LncRNA MALAT1在2型糖尿病患者中的表达及临床意义

杨大伟 黄庆 周连吉 欧丽娜 吴标良

(右江民族医学院附属医院内分泌科，广西 百色 533000)

2型糖尿病(T2DM)发病机制至今仍未完全明确〔1～4〕。近年来随着人类基因组学研究技术的发展，长链非编码RNA(LncRNA)逐渐进入人们的视野并引起广大科研人员的关注。越来越多的研究表明，LncRNA正在成为糖尿病发病环节中的积极参与者〔5,6〕。LncRNA肺癌转移相关转录本(MALAT)1是一种经典的，广为研究者研究的LncRNA。MALAT1广泛表达于多种组织中，最初的研究主要集中于它与肿瘤的关系方面〔7,8〕。但后来的研究表明，LncRNA MALAT1与糖尿病及糖尿病并发症之间的关系密切〔9〕。中国的一项研究中共收集了50例患有妊娠糖尿病的患者及47名健康孕妇，发现妊娠期糖尿病患者血清中LncRNA MALAT1水平升高〔10〕。Liu等〔11〕在研究中使用sh-MALAT1沉默了人脐静脉内皮细胞中的MALAT1表达，发现MALAT1沉默后，抵抗素(resistin),血管紧张素(Ang)Ⅱ,肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-6,可溶性细胞间黏附分子(sICAM)-1表达水平下降，胰岛素抵抗减轻，同时在小鼠模型中，观察到运动可以下调MALAT1水平，减少了胰岛素抵抗的发生。Yan等〔12〕在研究中发现高血糖能够引起视网膜内皮细胞和糖尿病大鼠视网膜中MALAT1 表达增加；沉默 MALAT1表达后，能够显著缓解糖尿病诱导的视网膜血管化、血管的渗漏和视网膜炎症。在糖尿病大鼠心肌细胞中，LncRNA MALAT1的下调，可以保护心肌细胞，并改善心功能〔13〕。另有研究发现，MALAT1在糖尿病肾病小鼠肾皮质中高表达，可以使β-catenin发生易位到细胞核上，同时会增强丝氨酸/精氨酸剪接因子1的表达，从而引起肾脏足细胞的损伤。而早期沉默MALAT1后足细胞功能得到了部分恢复〔14〕。

尽管以上研究说明了LncRNA MALAT1与糖尿病及其并发症的发生发展密切相关，但目前仍缺乏LncRNA MALAT1在T2DM人群表达情况的研究。本研究拟探讨 LncRNA MALAT1 在T2DM人群中的表达及临床意义。

1 材料和方法

1.1一般资料 共收集2017年1～7月在广西壮族自治区右江民族医学院附属医院住院部就诊的患者94例，其中糖尿病患者69例，同时选择正常健康体检者25例作为对照组。糖尿病组男44例，女25例，平均年龄(55.54±11.93)岁；体重指数(BMI)为(24.03±11.17)kg/m2，有吸烟史11例；对照组男14例，女11例，平均年龄(52.12±12.82)岁，BMI为(24.63±4.80)kg/m2，有吸烟史5例。两组一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组入组条件：①年龄35～65岁。②排除肿瘤、感染、传染性疾病等其他重大疾病。③符合2017年中国T2DM防治指南中T2DM的诊断标准〔15〕。对照组入组条件符合上述1、2条，但经糖耐量实验不符合糖尿病诊断者。本研究经医院伦理委员会审核通过，患者均知情同意。

1.2一般资料与临床指标收集 所有患者于入院时进行体格检查，收集体重、身高、血压、心率等基本资料，并计算BMI。空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂等生化指标使用迈瑞BS-2000M(迈瑞，中国深圳)全自动生化仪进行检测，胰岛素、皮质醇等使用全自动化学发光测定仪A2000(安图实验仪器有限公司，中国郑州)进行检测，所有检测由右江民族医学院附属医受过专业培训的技术人员进行。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)于次日8点在空腹状态下开始进行，将75 g无水葡萄糖溶入200～300 ml温开水中，于5 min内饮完，随即开始采血，并立即送检标本。使用胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)来评估患者胰岛素抵抗的情况，计算公式为HOMA-IR=FPG×空腹胰岛素/22.5。所有单位换算为国际标准单位。

1.3RT-PCR 所有患者于清晨8时开始采血，抽取5 ml静脉血，加入9 ml红细胞裂解液，混匀后于4℃下2 500 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，提取好的白细胞于-80℃下进行保存。使用Trizol 试剂盒(普飞，中国上海)抽提白细胞中的总RNA，然后使用Promega M-MLV 试剂盒(锐博生物，中国广州)进行反转录，反转录引物购自中国锐博生物有限责任公司。以上操作均严格按照试剂说明书进行操作。

PCR分析使用SYBR绿色试剂盒(天根生物，北京)。PCR条件：95℃ 15 min；(95℃ 10 s；60℃ 20 s )× 40 个循环。PCR使用溶解曲线评估。每个样本设置3个平行样，取平均值。以 2-ΔΔCt值表示LncRNA MALAT1的表达水平，ΔΔCt =(CTMALAT1-CTGADPH)DM-(CTMALAT1-CTGADPH)con。引物序列：MALAT1：上游5′-CAGACCACCACAGGTTTACAG-3′、下游5′-AGACCATCCCAAAATGCTTCA-3′，GADPH：上游 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、非参数检验、Spearman相关分析、二元Logistic 回归模型分析。受试者工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)用于评价诊断指标的诊断效能。

2 结 果

2.1两组临床资料对比 糖尿病组 FPG、超氧化物歧化酶(SOD)、HbA1C均显著高于对照组(P<0.01)，见表1。

2.2LncRNA MALAT1在两组表达 糖尿病组血清白细胞中LncRNA MALAT1表达水平(2.40±1.01)较对照组(1.04±0.28)明显升高(t=-6.587,P<0.001)。

2.3二元回归分析LncRNA MALAT1与T2DM发病之间的关系 使用二元Logistic回归分析对T2DM患者的发病的影响因素进行评估。结果显示LncRNA MALAT1(P<0.001，OR=11.667，95%CI：3.181～42.792)及SOD(P=0.018，OR=0.958，95%CI：0.925～0.993)是T2DM发病的影响因素。

2.4LncRNA MALAT1表达与OGTT实验中胰岛素分泌之间的相关分析 LncRNA MALAT1表达与SOD(r=-0.26，P=0.01)、HbA1c(r=0.35,P=0.001)、OGTT实验中胰岛素分泌(60 min)(r=0.35,P<0.001)及血糖(60、120、180 min)(r=0.35、0.40、0.39，均P<0.001)存在相关性，其余指标未见明显相关性。

2.5ROC曲线分析LncRNA MALAT1对T2DM的预测意义 AUC为0.807(95%CI： 0.708～0.906,P<0.001)，敏感度为 78.3%，特异度为 84.0%。见图1。可知，LncRNA MALAT1的表达对T2DM有一定的预测价值。

图1 ROC分析LncRNA MALAT1作为诊断T2DM血清标志物的生物潜能

3 讨 论

LncRNA被认为与细胞的分化、增殖、代谢及多种生命活动相关，参与许多疾病的发生与发展〔16～19〕。目前有研究指出多种LncRNA与糖尿病及其并发症的发生、发展有着十分密切的关系，包括H19〔20〕、MEG3〔21〕、uc.322〔22〕等。

本研究与Zhang等〔10〕研究结果是一致的，在妊娠期糖尿病患者中发现LncRNA MALAT1较正常孕妇升高。同时本研究说明LncRNA MALAT1对糖尿病患者的血糖控制是有影响的，同时也表明LncRNA MALAT1表达升高会导致糖尿病患者的血糖控制差而加速并发症的发生。这与近年来的研究指明LncRNA MALAT1参与糖尿病肾病〔23〕、糖尿病视网膜病变〔24〕的发病相符合。

本研究结果表明了LncRNA MALAT1可能影响了机体对高血糖的反馈调节。机体对于高血糖的正确反馈是分泌更多的胰岛素以降低过高的血糖，LncRNA MALAT1可能通过抑制胰岛素对高血糖的主动分泌而影响了血糖的升高。在Feng等〔25〕的研究中，LncRNA MALAT1可以通过下调miR124的表达抑制CDK4/E2F1信号通路来抑制乳腺癌的增殖，而CDK4/E2F1通路是影响胰岛素分泌的重要通路。这是否验证了我们的猜测，当然，这需要更进一步的研究去证明它们之间的联系。

SOD是人体内最重要的抗氧化剂，而氧化应激目前已被认为是糖尿病发病及诸多并发症发生发展的重要原因〔20〕。Gong等〔26〕研究显示，LncRNA MALAT1在糖尿病性白内障患者中同样与SOD的水平呈负性相关，并推测其可能通过p38MAPK信号通路来诱导了氧化应激的产生。Chen等〔27〕的研究发现在下调了LncRNA MALAT1的大鼠中，活性氧(ROS)明显下降。这些都表明LncRNA MALAT1可以诱导机体氧化应激反应。但是，LncRNA MALAT1诱导氧化应激参与T2DM发病的具体分子机制仍需要进一步探讨。

综上，LncRNA MALAT1在2型糖尿病患者中高表达，可作为其诊断的潜在标志物，其可能的机制不明，但或与氧化应激有关。