黑豆异黄酮的提取分离及其对DPPH自由基的清除能力

王宁 张叶韬 芦晓芳

摘要 基于超声时间、液料比和超声温度的单因素试验，通过响应面分析法优化，结合样品粉末的SEM表征，确定超声辅助法提取黑豆异黄酮的最优工艺条件;经大孔树脂（D-101）纯化黑豆异黄酮粗提物，继而以乙酸乙酯-甲醇（V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1）溶液洗脱过硅胶层析柱，得组分Ⅰ和组分Ⅱ;考察异黄酮、组分Ⅰ和组分Ⅱ体外抗氧化活性。结果表明：超声辅助法提取黑豆异黄酮的最优工艺参数为时间38 min，液料比32∶1，温度53 ℃，该条件下黑豆异黄酮提取量[（9.403±0.698） mg/g]最大;经大孔树脂（D-101）纯化得到纯度较高（异黄酮含量[（53.37±3.37）%]的异黄酮;过硅胶层析柱得组分Ⅰ和组分Ⅱ。当总异黄酮、组分Ⅰ和组分Ⅱ的浓度达到0.25 mg/mL时，DPPH·自由基清除率分别达到了（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，总异黄酮的清除率是组分Ⅰ和组分Ⅱ的2.06和1.70倍，总异黄酮、組分Ⅰ和组分Ⅱ的抗氧化能力依次为总异黄酮>组分Ⅱ>组分Ⅰ。

关键词 响应面法;异黄酮;分离纯化;抗氧化活性

中图分类号 TQ 914.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）01-0171-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.046

开放科学（资源服务）标识码（OSⅠD）：

Extraction of Isoflavones from Glycine max and Its Ability to Scavenge DPPH Free Radicals

WANG Ning， ZHANG Ye-tao， LU Xiao-fang

（Foundation Department， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract The optimal process conditions for ultrasonic-assisted extraction of isoflavones from Glycine max were determined based on univariate analysis of ultrasonic time， solid-liquid ratio and ultrasonic temperature， and SEM characterization of sample powder. After purifying the crude extract of isoflavones from Glycine max by the macroporous resin （D-101）， and silicagel column chromatographic separation in ethyl acetate-methanol （Vethyl acetate∶Vmethanol=10∶1）， component I and component II were obtained. The in vitro anti-oxidant activities of isoflavones， component I and component II were analyzed. The results showed that the optimal process parameters for the extraction of isoflavones from Glycine max  by the ultrasonic-assisted method were as follows： time， 38 min;liquid-solid ratio，32∶1;temperature， 53 ℃. Under these conditions， the extraction rate of isoflavones from Glycine max  achieved the highest （9.403±0.698）mg/g. Using the macroporous resin （D-101）， highly purified isoflavones were extracted from Glycine max  （53.37±3.37）%. Component I and component II were obtained from the silicagel column chromatographic separation. Under the concentrations of total isoflavones， component I and component II at 0.25 mg/mL， their DPPH free radical scavenging rate reached （71.28±1.41）%， （34.60±2.95）% and （42.01±1.34）%， respectively. In particular， the scavenging rate of total isoflavones was 2.06 and 1.70 times than that of component I and component II. The antioxidant capacity remained highest in total isoflavones， followed by component II， and component I.

Key words The response surface method;Isoflavones;Separation and purification;Antioxidant activity

基金项目 山西省高等学校大学生创新创业训练项目（202010113014）;山西农业大学博科研启动（J242098140）。

作者简介 王宁（1999—），男，山东临沂人，从事植物活性成分提取及活性研究。通信作者，副教授，博士，从事天然产物提取及活性研究。

收稿日期 2021-06-02

黑豆属于豆科大豆属植物，具有很强的环境适应能力，在气温较为寒冷、雨水量较少的北方有着广阔的种植面积[1-3]。作为具有预防和治疗多种疾病的食药同源物种之一的黑豆异黄酮含量较高[4]，因此其具有预防心血管疾病、治疗糖尿病、抗炎症、改善骨质疏松、降低乳腺癌的发病几率等功效[5-8]。目前，超声辅助提取天然产物大大提高了活性组分的溶出率[9]。因此，该研究采用响应面法优化黑豆异黄酮超声提取工艺，并经大孔树脂和硅胶柱分离纯化[10]，研究黑豆异黄酮最优提取分离方法，测定其体外抗氧活化活性[11]，以期为黑豆相关附加产品、功能食品等在臨床医学、制药、化妆品、保健等方面的开发和推广使用提供参考和理论依据[8]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 武乡黑豆，由山西农业大学大豆课题组提供。

染料木素标准品（纯度98%），成都植标化纯生物技术有限公司;石油醚（分析纯），天津市大茂化学试剂厂;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（分析纯，DPPH） ，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司;抗坏血酸（分析纯），中国医药公司北京采购供应站;无水乙醇（分析纯），天津市天大化工试验厂。

1.2 仪器与设备

UV1100紫外分光光度计，长沙科美分析仪器有限公司;YRE2000E旋转蒸发仪，巩义市予华仪器责任有限公司;GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司;KM-300DE中文液晶台式超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司;SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵，郑州予华仪器制造有限公司;DL-0506低温冷却液循环泵，河南兄弟设备仪器有限公司。

1.3 标准曲线的绘制

准确称取22.4 mg染料木素标准品溶于70% （V/V）乙醇溶液，定容至100 mL，分别吸取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 mL染料木素溶液，置于100 mL容量瓶中定容，即得不同浓度梯度的染料木素标准溶液。利用紫外分光光度计对染料木素标准溶液于200～600 nm处扫描，确定最大吸收波长，即含量检测波长。以不加样品的平行样作为空白对照，在最大的吸收波长处测定吸光度。以70%乙醇为空白对照，吸光度为纵坐标，标准品质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程（n=3）。

1.4 黑豆异黄酮的提取 黑豆异黄酮提取流程如图1所示，每组3次平行。按“1.3”中的方法测定溶液吸光度，根据回归方程计算黑豆异黄酮提取量。

黑豆异黄酮的提取量（mg/g）=C·V·n/m（1）

式中，C为黑豆异黄酮的质量浓度（mg/mL）;V为定容体积（mL）;n为稀释倍数;m为原料质量（g）。

1.5 单因素试验

1.5.1 超声时间对黑豆异黄酮提取量的影响。

准确称取脱脂黑豆粉末10 g，液料比40∶1（mL∶g），提取液为70%乙醇溶液，超声波功率270 W，温度60 ℃，分别设定超声时间为10、20、30、40、50和60 min。按“1.4”中方法计算黑豆异黄酮提取量。

1.5.2 超声温度对黑豆异黄酮提取量的影响。

准确称取脱脂黑豆粉末10 g，液料比40∶1，超声时间30 min，超声功率270 W，提取液为70%乙醇溶液，超声温度分别为25、40、50、60和70 ℃。按“1.4”中方法计算黑豆异黄酮提取量。

1.5.3 液料比对黑豆异黄酮提取量的影响。

准确称取脱脂黑豆粉末10 g，超声温度为 60 ℃，超声功率为 270 W，超声时间30 min，提取液为70%乙醇溶液，液料比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50。按“1.4”中方法计算黑豆异黄酮提取量。

1.6 响应面法优化黑豆异黄酮提取工艺

以超声时间（A）、液料比（B）和超声温度（C）3个条件为自变量因素，基于黑豆异黄酮超声提取单因素试验结果，设计响应面优化试验（表1），通过 Design Expert 12.0软件对试验结果进行回归分析，得到黑豆异黄酮最优提取工艺条件。

1.7 粉末SEM表征

扫描电子显微镜（VEGA Ⅱ RSU型，TESCAN公司），用于分析和描述黑豆细胞壁结构在不同条件（超声时间、液料比、超声温度）下提取前后的变化[12]。

1.8 TLC法检测黑豆异黄酮苷元

采用薄层层析法对黑豆异黄酮苷元进行初步分离检测。将薄层层析板切成高5 cm、宽1 cm 的板，在距下缘0.5 cm处点样（点样量约10 μL，点样直径≤2 mm），吹风机吹干。将薄板放入展开剂饱和后的层析缸中展开，展开剂为V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1，展开后吹干，紫外线波长 254 nm 处[13]检测黑豆异黄酮苷元斑点。

1.9 黑豆异黄酮的分离纯化 ①大孔吸附树脂预处理。将D101大孔树脂浸泡于体积分数为95%乙醇溶液中24 h，然后用蒸馏水洗涤至中性;再分别用体积分数为5% NaOH溶液浸泡12 h，洗涤至中性;最后用体积分数为5% HCl浸泡12 h，洗涤至中性，静置待用。

②将活化后的大孔树脂装柱，取质量浓度为2 mg/mL黑豆异黄酮粗提取液上样，先用蒸馏水冲洗，去除水溶性杂质，再用70%乙醇溶液洗脱，选用薄层色谱分析法跟踪检测，收集含黑豆异黄酮流出液。③活化后的硅胶粉干法装柱。将硅胶直接装入柱中，轻敲硅胶柱两侧，当硅胶高度到达合适位置后用泵将填料压实。将大孔树脂纯化后的黑豆异黄酮样品干法上样，以V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1为洗脱剂进行洗脱。

黑豆异黄酮纯度的计算公式[1]：

黑豆异黄酮纯度（%）=C·V/M×100%（2）

式中，C为洗脱液中黑豆异黄酮质量浓度，mg/mL;V为洗脱液体积，mL;M为粗异黄酮质量，g。

1.10 DPPH自由基清除能力的测定

准确称取样品12.5 mg，以抗坏血酸为对照，95%乙醇溶解，定容至50 mL，准确量取2、4、6、8、10 mL分别稀释至10 mL，得到浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的样品溶液。测定不同浓度样品的清除能力，各组分别编号1～5（表2）。暗反应30 min，517 nm处[13-14]测定吸光度。各组试剂加入量见表2。

样品对DPPH自由基清除率计算公式：

清除率=[1-（A1-A2）/（A1-A0）]×100%（3）

式中，A0为标0组的吸光度;A1为对照组吸光度;A2为黑豆异黄酮样液或抗坏血酸与DPPH混合溶液的吸光度。

1.11 数据处理 采用Microsoft Office软件进行数据统计，利用Origin 2017软件及Design-Expert 12.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 黑豆异黄酮标准曲线绘制 染料木素标准品全波段扫描结果见图2。从图2可见，染料木素最大吸收波长为288 nm。

从图3可见，回归方程为y=35.341 0x-0.009 5，R2=0.999 3，在该范围内（0～0.016 mg/mL）有良好的线性关系。

2.2 单因素试验分析

2.2.1 超声时间对黑豆异黄酮提取量的影响。

从图4可见，在温度60 ℃、液料比40∶1、70%乙醇、功率270 W的条件下，黑豆异黄酮提取量随超声时间的延长呈先增加后降低的趋势。当时间达到40 min时，黑豆异黄酮提取量达到最大值（9.402 68±0.103 73） mg/g，分别为10、20、30、50、60 min的3.14、2.32、1.29、1.23、1.90倍。原因可能为超声时间小于40 min时，随着超声时间增加，提取液与黑豆粉接触时间增多，黑豆异黄酮溶出率提高，当黑豆异黄酮溶出完全后，随着提取时间的增加，杂质溶出率也会相应上升，最终导致黑豆异黄酮提取量降低;其次，超声时间增加，可能导致黑豆异黄酮结构破坏，使其提取量降低。因此，40 min为黑豆异黄酮超声提取最佳时间。

2.2.2 超声温度对黑豆异黄酮提取量的影响。由图5可知，在液料比40∶1，超声时间30 min，乙醇浓度70%，功率为270 W的条件下，黑豆异黄酮提取量随温度缓慢升高。当温度达到60 ℃时，提取量达到最大（9.606 41±0.340 11） mg/g。在超声时间为60 ℃时，提取量分别是25、40、50 ℃的1.40、1.34、1.13倍;当温度达到70 ℃时，其提取量分别是25、40、50 ℃的1.42、1.35、1.14倍。而温度为70 ℃的提取量仅仅是温度60 ℃的1.01倍。因此，从节能的角度考虑，选择60 ℃作为最佳温度。

2.2.3 液料比对黑豆异黄酮提取量的影响。

由图6可知，在时间30 min、温度60 ℃、乙醇浓度70%、功率270 W的条件下，随着液料比不断增大，黑豆异黄酮提取量呈先增大后减小的趋势。当液料比为30∶1时，黑豆异黄酮提取量最大，为（9.397 02±0.294 55） mg/g，且分别是液料比10∶1、20∶1、40∶1和50∶1的1.76、1.20、1.35和1.30倍;液料比60∶1与30∶1的黑豆异黄酮提取量相差不大。这可能是在液料比为30∶1时有足够的溶剂将黑豆异黄酮溶出，再增大液料比会导致黑豆其他杂质溶出，影响了黑豆异黄酮的提取。因此，黑豆异黄酮的最佳提取液料比为30∶1。

2.3 响应面法优化结果

2.3.1 模型建立和显著性分析。

采用 Design-Expert 8.0.6 软件对中心试验设计及试验结果（表3）进行分析，以Y为黑豆异黄酮的响应值，其与超声时间（A）、液料比（B）、超声温度（C）之间的多元二次回归模型方程为

Y=9.620 0-0.129 7A+0.123 7B-0.654 3C-0.511 4AB+1.200 0AC-0.260 2BC-1.840 0A2-1.230 0B2-0.301 2C2

由表4可知，P<0.001，表明回归模型具有高度的显著性。失拟值 P=0.117 0> 0.05，没有显著差异，说明回归方程与试验拟合良好，误差小。经计算，确定系数 R2=0.958 4，表明该模型设计预测值与实际值相近，有良好的线性关系;调整系数R2adj=0.905 0，經调整后，说明该试验所建立的模型可以解释的响应值变化有90.50%。故该模型不仅可以得到黑豆异黄酮提取的最优工艺，还可以反映黑豆异黄酮类化合物的含量。从F值可以看出，各因素对黑豆异黄酮提取量的影

响表现为超声温度（C）>超声时间（A）>液料比（B），试验因素中，一次项C，交互项AC和二次项A2、B2的P值均小于0.01，说明对试验结果有着极显著影响，而其余项的P值均大于0.05，对试验指标影响不显著。

2.3.2 响应面交互作用分析。

为了更直观地表现2因素间的交互作用对黑豆异黄酮提取量的影响，根据超声时间、超声温度和液料比对黑豆异黄酮提取量的影响，控制某一因素不变，改变另外2个因素，绘制响应面图和等高线图。

基于二次回归模型建立响应面，分别绘制出各因素之间相互作用、相互影响的响应面和等高线图（图 7～9）。

由图7a可知，超声时间与液料比的变化曲面呈较为扁平的椭圆形，说明这2个因素对黑豆异黄酮提取量的作用较为显著，结合图7b的响应面（较为陡峭），进一步验证超声时间与液料比对异黄酮提取量的影响较大。

由图8a可知，超声时间与超声温度的变化曲面呈扁平状，说明这2个因素对黑豆异黄酮提取量的影响较大，图8b的响应面较为陡峭，相比图7更为明显，且可看到超声温度较超声时间对黑豆异黄酮提取量的影响大。

图9a可知，液料比与超声温度的变化曲面呈扁平状，图9b的响应面与图7b和图8b相比并不陡峭，说明液料比和超声温度的交互作用对黑豆异黄酮提取量的影响不显著。

2.3.3 验证试验。

通过响应面分析得出该模型最优结果：液料比38.063∶1，超声时间31.604 min，超声温度53.207 ℃，黑豆异黄酮提取量的理论值为10.073 mg/g。但是该试验条件在实际试验操作中难以完全实施，故对所得理论值进行一定的修正，得到便于试验操作的提取条件：超声时间38 min，液料比32∶1，超声温度53 ℃。对优化后的条件进行3次重复试验，验证得到黑豆异黄酮的提取量为（9.403±0.698） mg/g，与预测值相近，证明该模型能够预测黑豆异黄酮的总提取量。

2.4 不同方法提取黑豆异黄酮样品粉末SEM表征

为了进一步证明超声辅助提取法对黑豆异黄酮提取量的影响，不同提取条件下，黑豆粉末的破损程度见图10。由图10可知，细胞的破损程度从大到小依次为图10d、图10c、图10a、图10b，其提取量依次为（9.403±0.698）、（6.805±0.212）、（3.021±0.774）、 （1.878±0.223） mg/g。

2.5 黑豆异黄酮的分离纯化

70%乙醇溶液洗脱，过大孔树脂，得到纯度达到（53.37±3.37）%的黑豆异黄酮。V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1为展开剂，薄层硅胶板点样（黑豆异黄酮），荧光下明显可见2点（图11），Rf值分别为1.8 cm （组分 Ⅱ）和3.2 cm （组分 Ⅰ）。经硅胶层析柱分离纯化得组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ。

2.6 黑豆异黄酮、组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ 的DPPH自由基清除能力检测

由图12可知，在试验浓度范围内（0～0.25 mg/mL），黑豆异黄酮、组分 Ⅰ  和组分 Ⅱ 对DPPH自由基有清除能力，且与浓度呈正相关，当浓度达到0.25 mg/mL时，黑豆异黄酮、组分Ⅰ和组分Ⅱ的清除率达到（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，黑豆异黄酮的清除率是组分Ⅰ和组分Ⅱ的2.06和1.70倍。黑豆异黄酮、组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ 的抗氧化能力表现为黑豆异黄酮>组分Ⅱ>组分Ⅰ。

3 结论

（1）该研究以黑豆为原料，经去脂等预处理，超声辅助提取黑豆异黄酮类化合物，基于超声时间、液料比和超声温度单因素试验，通过响应面优化提取工艺，确定超声辅助法提取黑豆异黄酮的最优工艺参数：超声时间38 min，液料比32∶1 ，超声温度53 ℃。在该条件下黑豆异黄酮提取量达（9.403±0.698） mg/g。影响黑豆异黄酮提取量的因素表现为超声温度（C）>超声时间（A）>液料比（B）。按响应面设计最佳提取条件，3次重复试验实际提取量与预测值（10.073 mg/g）接近。

（2）经大孔树脂（D-101）纯化黑豆异黄酮粗提物，得到纯度较高[（53.37±3.37）%]的黑豆异黄酮，过硅胶层析柱，展开剂为V乙酸乙酯∶V甲醇=10∶1，得组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ。

（3）黑豆异黄酮、组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ 体外抗氧化活性结果表明：黑豆异黄酮、组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ 的浓度达到0.25 mg/mL时，DPPH自由基清除率分别达到（71.28±1.41）%、（34.60±2.95）%和（42.01±1.34）%，黑豆异黄酮的清除率是组分Ⅰ

和组分Ⅱ的2.06和1.70倍。黑豆异黄酮、组分 Ⅰ 和组分 Ⅱ

的抗氧化能力表现为黑豆异黄酮>组分 Ⅱ>组分 Ⅰ。

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