柱前衍生-液相色谱-串联质谱法测定环境水体中草甘膦及其代谢产物的影响因素研究

董建芳 董会军 李义 赵峰 马天翼 刘雪瑜

摘 要：为了更好地了解水中草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸的浓度水平，采用柱前衍生-液相色谱-串联质谱法对其进行测定。采用Inert Sustain Bio C18 HP色谱柱，乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，水浴-超声50 ℃衍生60 min，正离子模式，内标法定量，测定水样中的草甘膦和氨甲基磷酸;并探讨了质谱条件、色谱条件、衍生条件、保存时间、采样保存容器、金属离子因素对草甘膦回收率的影响。结果表明，草甘膦和氨甲基膦酸的方法定量限分别为0.030，0.028 μg/L，加标回收率为83.4%～108%，相对标准偏差（n=6）为2.6%～8.0%。通过大量实际样品测定，内标物回收率控制在74.5%～129%。采用的测定方法准确，抗干扰能力强，检测结果能够满足《地下水质量标准》（GB/T 14848—2017）Ⅰ类水限值要求，研究结果对保护水体生态安全具有重要的参考价值。

关键词：质谱分析;液相色谱-串联质谱法;环境水体;草甘膦;氨甲基膦酸;影响因素

中图分类号：X592;O657.63   文献标识码：A   DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx01010

Abstract：In order to better understand the concentration level of glyphosate and its metabolite aminomethyl phosphonic acid in water，the precolumn derivatization-liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to determine the contents.Glyphosate and aminomethyl phosphoric acid were determined in water samples in the conditions with Inert Sustain Bio C18 HP column，and acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution was used as the mobile phase，water bath ultrasonic derivatization at 50 ℃ for 60 min，positive ion mode and the contents of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid were determined by using internal standard method.The effects of mass spectrometry conditions，chromatographic conditions，derivatization conditions，storage time，storage container and metal ions on the recovery were discussed.The results show that the method quantitative limits of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid are 0.030 and 0.028 μg/L respectively.The recovery rates range from 83.4% to 108% with relative standard deviations （n=6） ranging from 2.6% to 8.0%.Through the determination of a large number of actual samples，the recovery rates of internal standard are controlled at 74.5% to 129%，the method is accurate and has strong anti-interference ability，which can meet the requirements of class Ⅰ water limit in the quality standard for groundwater （GB/T 14848-2017）.The results of the research have important guiding significance for the protection of water safety.

Keywords：mass spectrometry analysis;liquid chromatography-tandem mass spectrometry;environmental water;glyphosate;aminomethyl phosphonic acid;influencing factors

草甘膦（glyphosate，GLY）是一種内吸传导型广谱灭生性除草剂，其主要的代谢产物是氨甲基膦酸（aminomethyl phosphonic acid，AMPA）。近年来，草甘膦以高效、低毒被广泛应用，但是随着草甘膦的产量和使用量日益增加，大量的草甘膦能够在土壤中被吸附、迁移，并通过扩散转移到水体中[1-3]。草甘膦具有较长的半衰期（7～315 d，通常为45～60 d），导致草甘膦在环境水体中不断累积并持续存在[1]，对人体健康具有一定的毒性，对生态环境具有潜在的危害，因此其安全问题成为关注的焦点[2-6]，国际癌症研究机构（IARC）研究报告也指出，草甘膦农药可能会引发淋巴腺癌和肺癌。在中国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2006）和《地下水质量标准》（GB/T 14848—2017）中均设有草甘膦指标，同时给出了相应的限值要求，生活饮用水的限值为0.7 mg/L，地下水的Ⅰ类水限值为0.1 μg/L。

草甘膦和氨甲基膦酸均属于强极性化合物，易溶于水，不含发色和荧光官能团。同时，草甘膦具有磷酸基（—H2PO3）、氨基（—NH2）和羧基（—COOH）官能团，氨甲基膦酸具有氨基（—NH2）和羧基（—COOH）官能团，在pKa为2，2.6，5.6和10.6时能够与金属离子形成稳定的络合物[7-13]。正因为草甘膦和氨甲基膦酸的特殊性质，探讨准确测定痕量草甘膦及其代谢产物的影响因素是非常有意义的。

目前，草甘膦和氨甲基膦酸的主要检测方法有离子色谱法[14-15]、离子色谱-质谱法[16]、气相色谱-质谱法[17]、柱前衍生-固相萃取-液相色谱法[18-19]，这些方法存在灵敏度低（0.5 μg/L～0.1 mg/L），定性能力和选择性差、前处理繁琐，需消耗大量有机溶剂，不能满足《地下水质量标准》（GB/T 14848—2017）Ⅰ类水限值要求等问题。而液相色谱-串联质谱法灵敏度高，选择性强[20-24]。本文采用柱前衍生-液相色谱-串联质谱法，探讨测定草甘膦及其代谢产物的影响因素，提高检测的灵敏度和准确性，对掌握环境水体中草甘膦和氨甲基膦酸的农药残留状况、有效指导环境水体的质量评价和管理提供技术支撑，对保护水体安全具有重要的现实意义。

1 实验材料与方法

1.1 仪器与试剂

1）仪器 液相色谱-串联质谱仪（LCMS8050，日本岛津公司提供）;液相色谱柱：Inert Sustain Bio C18 HP（150 mm×2.1 mm，3 μm）。

2）试剂 甲醇（色谱纯，美国Fisher公司提供），乙腈（色谱纯，美国Fisher公司提供），乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供），甲酸（LCMS级，上海安谱科学仪器有限公司提供）;抗坏血酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供）、四水合硼酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供）、磷酸（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙二胺四乙酸二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供）、9-芴基甲基氯甲酸酯（纯度97%，上海安谱科学仪器有限公司提供）。

草甘膦标准溶液、氨甲基膦酸标准溶液，质量浓度均为100 mg/L、内标物草甘膦-13C2 15N（质量分数97.3%）均由美国o2si公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器条件

流动相A：5 mmol/L乙酸铵水溶液;流动相B：乙腈;梯度洗脱程序：0～6 min时8%～35%B，6～8 min时35%～100%B，8～8.1 min时100%～8%B，8.1～10 min时8%B;流速为0.4 mL/min，进样量为10.0 μL，柱温为40 ℃。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式，脱溶剂管温度250 ℃，离子源温度350 ℃，雾化气流速3 L/min，干燥气流速10 L/min，加热气流速10 L/min;定性与定量离子对、碰撞能（CE）、Q1 Pre Bias和Q3 Pre Bias见表1。

1.2.2 实验步骤

准确量取水样10.0 mL，加入50 μL内标使用液（0.2 mg/L），混匀后依次加入0.3 mL抗坏血酸溶液（0.4 g/L）、0.5 mL的5%硼酸盐缓冲溶液、1mL的9-芴基甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）溶液（2 g/L），适量乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液，混匀后在50 ℃水浴超声条件下衍生60 min，加入0.6 mL磷酸溶液中和反应，混匀后用0.22 μm PTFE滤膜过滤到进样瓶中，上机测定，内标法定量。

2 结果与讨论

2.1 质谱和色谱条件对测定结果的影响

在两通状态下，用10 μg/mL的混合标准衍生溶液在正离子和负离子模式下进行全扫描。结果表明：正离子负离子模式均具有较好的响应值，可能因为草甘膦和氨甲基膦酸的两性物质化学性质，本文采用正离子模式，选择准分子离子峰[M+H]+作为母离子，进行产物离子扫描，选择丰度较高、干扰较小的离子作为定量离子和定性离子，優化MRM参数，确定最终的质谱条件参数，见表1。

本文考察了色谱柱1（Inert Sustain Bio C18 HP;150 mm×2.1 mm，3 μm）、色谱柱2（Shim-pack XR-ODS;150 mm×2.0 mm，1.9 μm））2种色谱柱对草甘膦等的分离效果。考察了流动相1（乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液）、流动相2（甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液）、流动相3（乙腈-5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液）对草甘膦等的分离效果和保留强度。实验结果见图1。

由图1中的a）—f）可以看出，由于草甘膦和氨甲基膦酸强极性的性质，普通C18色谱柱上很难进行分离和保留，本试验选取的2种色谱柱对草甘膦等能够进行很好的分离，但是色谱柱2的峰形明显展宽拖尾，色谱柱1的峰形对称，尖锐，分离效果和保留强度良好，主要是因为其内壁有PEAK材质涂层，能够有效避免强极性化合物的吸附作用。流动相的选择包括有机流动相和水相溶液两部分，对于有机流动相，考察了乙腈和甲醇，由图1中a）—c）和g）—i）得出乙腈具有更好的洗脱能力，能够进行有效分离，对于水相溶液流动相，由图1中a）—c）和j）—l）可以看出，当流动相中含有甲酸时，草甘膦等不能有效分离，乙酸铵使流动相pH值更稳定，能够达到良好的分离效果。

因此本实验采用Inert Sustain Bio C18 HP色谱柱，乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，能够达到很好的分离效果和保留强度。

2.2 衍生条件对测定结果的影响

草甘膦和氨甲基膦酸属于强极性化合物，采用柱前衍生的方式来降低它们的极性，增加化合物在色谱柱中的保留，来改进质谱检测。本方法考察了衍生时间和衍生温度对回收率的影响。针对室温（RT）、水浴（WB）、水浴-超声（WB-UT）3种衍生方式，分别选取反应时间为30，60，90 min进行方法实验，实验结果见图2。

由图2可以看出，采取室温、水浴、水浴超声3种方式，草甘膦和氨甲基膦酸的回收率均随衍生时间增加而升高，并发现在室温条件下衍生90 min，回收率小于60%，在水浴50 ℃条件下衍生，回收率达到85%，在水浴超声条件下，衍生60 min，回收率可达到98%。由此可知，在水浴超声条件下可促进衍生反应的进行，因此本试验采用水浴50 ℃超声衍生。

2.3 保存容器和保存时间对测定结果的影响

在《地下水质量标准》（GB/T 14848—2017）、《生活饮用水标准检验方法》（GB/T 5750—2006）、《城镇供水水质标准检验方法》（CJ/T 141—2018）、《水质 草甘膦和AMPA的测定 高效液相色谱法（HPLC）串联质谱检测法》（ISO 16308—2014）和《水质 草甘膦的测定 高效液相色谱法》（HJ 1071—2019）等相关标准中所给出的草甘膦样品的保存容器不尽相同，

同时有标准方法提出草甘膦在玻璃表面有强吸附作用。本文考察了棕色玻璃瓶（G）、聚乙烯瓶（PE）2种材质的容器对草甘膦和氨甲基膦酸的吸附作用。实验将加标质量浓度为5.00 μg/L的草甘膦和氨甲基膦酸，置于不同容器中分别保存1，3，5，7，10，14 d，通过比较回收率来确定适合的采样容器和保存时间。实验结果见图3。

由图3可以得出，草甘膦和氨甲基膦酸在聚乙烯瓶的回收率整体略高于玻璃瓶的回收率，吸附率小于3%，因此认为2种材质的采样容器基本无差异，可忽略吸附作用。氨甲基膦酸的回收率整体略高于草甘膦的回收率，草甘膦在保存过程中可能存在少量转化为其代谢产物氨甲基膦酸，转化率小于5%。保存时间为7 d时，不同容器2种物质的回收率均在85%以上，保存时间为14 d时，回收率在75%以上，因此，在7 d以内完成草甘膦等的分析，结果更加准确可靠。

2.4 金属离子对测定結果的影响

草甘膦和氨甲基膦酸作为两性物质，具有较强络合金属的能力，草甘膦和金属离子的结合能力强弱与金属离子的种类和价态有关[25]，三价和二价金属结合能力较强，水样中的金属离子易和草甘膦等进行络合反应[8，11，13]。以草甘膦为例，图4为2个草甘膦和4个草甘膦分别和金属离子（M）络合物的结构，图5为草甘膦和9-芴基甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）的衍生反应[26-28]。

由图4和图5可以看出，环境水体中的金属离子不仅能够和草甘膦形成稳定的络合物，也可与草甘膦-13C215N和氨甲基磷酸形成稳定的络合物，从而影响草甘膦和氨甲基膦酸的痕量测定，以及内标物草甘膦-13C215N的回收率。在衍生时，需加入适量EDTA-Na2以使草甘膦等成分从金属离子络合物中释放出来，从而提高其回收率。影响回收率的主要为三价和二价的金属离子，而EDTA-Na2能够络合水体中的所有金属离子，因此其加入量和水体的总硬度相关。考察了草甘膦和氨甲基磷酸质量浓度为5 μg/L时，总硬度对回收率的影响程度，同时以总硬度（以CaCO3计）质量浓度为2 000 mg/L为例，考察了总硬度和EDTA-Na2的物质的量比分别为1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4时对回收率的影响。模拟环境水体表征总硬度的金属离子主要有Cu2+，Zn2+，Mn2+，Ca2+，Mg2+，Fe3+。

由图6和图7可以得出，总硬度（以CaCO3计）质量浓度为0～2 000 mg/L，涵盖了大部分环境水体的范围，对草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影响显著，随着EDTA-Na2的加入量增加，其回收率明显升高，当总硬度与EDTA-Na2的物质的量比为1∶1时，并不能将其完全释放出来，物质的量比为1∶3时，回收率与其在纯水中的回收率基本一致，当物质的量比为1∶4时，回收率并未下降，表明过量的EDTA-Na2不会影响草甘膦和氨甲基磷酸测定的准确度。

2.5 方法特性指标

由以上实验得出优化后的衍生条件和检测条件：在水浴超声50 ℃条件下衍生60 min，用0.22 μm PTFE滤膜进行过滤，采用Inert Sustain Bio C18 HP色谱柱，乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相进行分析，同时可使用软件预处理程序，在线稀释水样，但不减少进样量，不降低灵敏度，能够达到降低基质效应干扰的效果，通过内标物响应值的回收率（70%～130%）来评价仪器和基体效应的影响程度。

制备衍生的标准系列，质量浓度为0.020～10.0 μg/L时线性良好。对质量浓度为0.020 μg/L的草甘膦和氨甲基膦酸混合标准样品进行n次的平行测定（n=11），计算方法检出限MDL=t（n-1，0.99）×S，方法定量限按照4倍MDL来计算，在环境水样中添加0.400，4.00，8.00 μg/L混合标样进行衍生处理，平行测定6次，计算精密度和加标回收率，方法特性指标数据见表2。

3 结 语

本文建立了柱前衍生-液相色谱-串联质谱法测定水中的草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸的分析方法，采用Inert Sustain Bio C18 HP色谱柱，乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，能够达到很好的分离效果和保留强度;采用玻璃瓶和聚乙烯瓶进行对比，聚乙烯瓶的回收率整体略高于玻璃瓶的回收率，吸附率小于3%，差异和吸附作用可忽略;在7 d内完成样品分析，回收率在85%以上;加入EDTA-Na2溶液来避免金属离子对草甘膦等的络合作用，过量的EDTA-Na2不会影响结果的准确度。应用此方法，开展了近3 000组实际样品的检测工作，内标物的回收率为74.5%～129%。本文所建立的方法准确稳定可靠，抗干扰能力强，具有明显的技术优势，能够批量处理多组样品，有效降低检测成本，适用性强，可为后续的水体质量评价和利用提供准确的数据支撑。

本文仅对草甘膦及其主要代谢产物氨甲基膦酸进行了测定，草铵膦及其他代谢产物（如N-乙酰草甘膦、N-乙酰草铵膦、N-乙酰氨甲基膦酸）同样具有相似的毒性，后续应进一步开展相关的研究，了解这些成分在水中的浓度水平和代谢行为。

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