ESM-1、Vaspin在脑出血患者脑组织中的表达水平及其与病情程度的关系▲

唐流洋 刘 霞 胡 锐

(重庆市綦江区人民医院神经外科，重庆市 401420)

自发性脑出血是中老年患者常见的致残、致死原因，尽管当前医疗技术明显提高，但脑出血的病死率仍居高不下，在53%～59%之间[1]。脑出血主要是由于薄弱的脑动脉血管破裂，导致血液外渗，脑实质局部压力增加，进而发生脑水肿、氧化应激和炎性反应，对患者造成继发性伤害。脑出血最常见于基底节部，其次是大脑皮层和脑干。研究表明，脑出血与肥胖、高血压、糖尿病、饮酒等因素密切相关[2]，上述因素可长期刺激血管内皮，导致血管内皮细胞变性、凋亡，最终引起血管破裂，发生脑出血。一些学者提出脑血管内皮功能紊乱是脑出血的病理基础[3]。有研究结果显示，内皮细胞特异性分子-1(endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)属于可溶性硫酸皮肤素蛋白聚糖，是一种与内皮功能紊乱有关的标志物，其参与血管内皮细胞增殖、黏附和迁移，与血管生长因子相互作用，共同维持血管内皮细胞稳定[4-5]。Zhu等[6]发现，ESM-1参与调控人神经胶质瘤的血管生成。内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor,Vaspin)是一种胰岛素增敏剂和抗炎因子，Vaspin可以调控血管内皮炎症因子表达，能够对抗细胞凋亡，保护血管内皮[7]。Zhang等[8]研究发现，Vaspin通过抑制肾脏核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路，从而减轻肾脏组织的炎症反应和缺血再灌注损伤，保护血管内皮。本文旨在探讨ESM-1、Vaspin在脑出血患者脑出血点附近脑组织中的表达水平及其与疾病严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年6月至2021年7月在我院神经外科确诊为脑出血的84例患者作为研究对象，其中男性46例、女性38例，年龄42～76(59.78±11.60)岁。纳入标准：(1)脑出血的诊断符合《中国脑出血诊治指南(2014)》[9]中的相关标准，患者均经头颅CT检查确诊为脑出血且行血肿清除术；(2)均为首次发病，并且在脑出血后24 h内入院；(3)近期未使用抗生素、免疫抑制剂。排除标准：(1)既往有脑创伤、脑卒中、脑肿瘤等病史的患者；(2)合并精神或其他神经系统疾病的患者；(3)脑血管瘤、脑血管畸形等继发性脑出血患者；(4)合并急慢性感染的患者。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者或家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 收集临床资料：收集患者的性别、年龄、合并基础疾病(高血压、糖尿病、高脂血症)情况；入院时采用美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)对患者病情严重程度进行评估[10]；通过头颅影像学评估脑出血情况，并采用多田公式计算脑出血量[11]；出院后随访3个月，采用格拉斯哥预后量表(Glasgow Outcome Scale，GOS)评分[12]评估患者预后情况。

1.2.2 组织标本收集：所有患者均接受血肿清除手术治疗。术中选取手术通路中邻近血肿0.5 cm以内的脑组织碎块0.3 g作为脑出血组，取同一脑出血患者距出血边缘>2 cm的脑组织碎块0.3 g作为对照组，将收集到的样本先速冻于液氮中，随后贮存在-80 ℃冰箱中备用。

1.2.3 免疫组化法检测ESM-1和Vaspin的蛋白表达情况：将术中获取的部分脑组织制作成5 μm厚度的切片，58 ℃恒温烘烤2 h，依次使用二甲苯、酒精、3%过氧化氢溶液处理标本，然后柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)进行抗原修复；分别滴加抗ESM-1抗体或Vaspin抗体(稀释比例为1∶100；北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-3615R、bs-7536P)100 μL，4 ℃下孵育过夜，PBS洗片，然后滴加生物素化山羊抗兔IgG(无须稀释；北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：PV-6000)100 μL，37 ℃孵育30 min，随后使用PBS溶液清洗干净后，DAB染色2 min，苏木精复染1 min，乙醇脱水，玻璃片固定。

在电子显微镜下随机选择5个视野检查ESM-1及Vaspin的蛋白表达情况。如细胞质和/或细胞核呈棕黄色颗粒，则判定为阳性细胞。由两位高年资病理医师采用双盲法对切片染色结果进行观察和评估，如有差异，则重新评估建立最终评分。具体评估标准见下表1，以着色程度计分与阳性细胞百分比计分相乘所得总计分来判定表达情况，将>4分定义为阳性表达。

表1 染色评估标准

1.2.4 实时荧光定量PCR检测ESM-1和Vaspin的mRNA表达量：将剩下的脑组织样本使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific公司，货号：K0731)提取RNA，根据M-MLV反转录试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，货号：R1042]进行反转录；然后使用荧光定量染料(北京索莱宝科技有限公司，货号：SR1110)配制反应体系，反应体系包括cDNA 5 μL、反应预混液12.5 μL、正向引物(10 μmol/L)0.5 μL、反向引物(10 μmol/L)0.5 μL、去离子水6.5 μL。在ExicyclerTM96(BIONEER公司)定量系统上采集信号，扩增程序为预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，变性—退火/延伸共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算ESM-1和Vaspin的mRNA相对表达量。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表2。

表2 引物序列

1.3 统计学分析 使用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计数资料采用例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；相关性分析采用Pearson检验；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线绘制脑出血组织中ESM-1 mRNA与Vaspin mRNA表达量对脑出血患者预后的预测效能，其中曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.70～0.85时预测价值一般，>0.85时预测价值较好，AUC的比较采用Z检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑出血患者脑组织中ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率及ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表达量的比较 对照组脑组织中ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率，以及ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表达量均高于脑出血组(均P<0.05)。见表3、图1、图2。

表3 脑出血患者脑组织中ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量的比较

图1 ESM-1蛋白在脑组织中的阳性表达(免疫组化染色，×100)

图2 Vaspin蛋白在脑组织中的阳性表达(免疫组化染色，×100)

2.2 不同病情严重程度患者脑出血点附近脑组织ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率的比较 按入院时NIHSS评分将患者分为轻型组33例(NIHSS评分1～4分)、中型组26例(NIHSS评分5～15分)、重型组25例(NIHSS评分>15分)。3组患者的性别、年龄、合并基础疾病情况比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，而轻型组脑出血点附近脑组织中的ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率均高于重型组(均P<0.05)。见表4。

表4 不同病情严重程度患者一般资料及脑出血点附近脑组织ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率的比较

2.3 不同出血量患者脑出血点附近脑组织中ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率的比较 根据入院时出血量将患者分为小量出血组31例(脑出血量<15 mL)、中量出血组28例(脑出血量15～30 mL)、大量出血组25例(脑出血量>30 mL)。3组患者的性别、年龄、合并基础疾病情况比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，而小量出血组脑出血点附近脑组织中ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率均高于大量出血组(均P<0.05)。见表5。

表5 不同出血量患者一般资料及脑出血点附近脑组织ESM-1、Vaspin蛋白阳性表达率的比较

2.4 脑出血患者脑出血点附近脑组织中ESM-1、Vaspin mRNA表达量的相关性 脑出血患者脑出血点附近脑组织中ESM-1 mRNA表达量与Vaspin mRNA表达量呈正相关(r=0.674，P<0.001)。见图3。

图3 脑出血患者脑出血点附近脑组织中ESM-1 mRNA表达量与Vaspin mRNA表达量的相关性

2.5 脑出血点附近脑组织ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表达量对脑出血患者预后的预测效能 所有患者出院后均随访3个月，按GOS评分分为预后良好组49例(GOS评分>4分)与预后不良组35例(GOS评分≤4分)。ROC分析结果显示，脑出血点附近脑组织ESM-1 mRNA表达量预测脑出血患者预后不良的AUC为0.842(95%CI:0.784，0.901)，截断值、敏感度、特异度分别为1.38、83.30%、72.30%；脑出血点附近脑组织Vaspin mRNA表达量预测脑出血患者预后不良的AUC为0.896(95%CI:0.846，0.946)，截断值、敏感度、特异度分别为1.46、83.30%、84.30%；ESM-1 mRNA表达量、Vaspin mRNA表达量联合预测的AUC为0.947(95%CI:0.914，0.981)，敏感度及特异度分别为91.70%、83.20%。ESM-1 mRNA表达量、Vaspin mRNA表达量单独预测脑出血患者预后不良的AUC差异无统计学意义(Z=1.383，P=0.167)，二者联合预测脑出血患者预后不良的AUC大于ESM-1 mRNA表达量(Z=3.045，P=0.002)，但与Vaspin mRNA表达量相比差异无统计学意义(Z=1.687，P=0.092)。见图4。

图4 脑出血点附近脑组织ESM-1 mRNA表达量、Vaspin mRNA表达量预测脑出血患者预后不良的ROC曲线

3 讨 论

脑出血好发于秋冬季节，与患者情绪波动有关，具有发病急、进展快、预后差等特点，因此，早期判断病情严重程度和疾病转归，将有助于提高治疗效果。研究表明，自发性脑出血的主要原因为高血压，高血压产生的机械应变力引起血管壁损伤，进而破坏血管内皮细胞以形成颅内微小血管瘤[13]。Kang等[14]通过小鼠实验发现，内皮酶对损伤后血管修复过程具有重要作用，提示其可能是血管内皮细胞修复的潜在靶点。目前关于脑血管自我修复的潜在靶点的研究较少，本研究观察了正常脑组织与脑出血点附近脑组织中ESM-1、Vaspin的表达情况，为脑血管自我修复提供新靶点。

ESM-1是一种免疫炎症标志物，与脑血管疾病相关，在调节血管内皮黏附中发挥重要作用，在血浆中能够维持内皮细胞的完整功能[15]。ESM-1还可以通过激活氧自由基，诱导神经系统氧化应激反应，进而影响神经细胞的能量代谢。同时，ESM-1也是内皮细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信号的调节因子，这可能对脑出血血管修复具有潜在的治疗价值[16]。本研究结果显示，对照组ESM-1蛋白阳性表达率及mRNA表达量均高于脑出血组，且轻型组、小量出血组脑出血点附近脑组织中的ESM-1蛋白阳性表达率分别高于重型组、大量出血组(均P<0.05)，说明脑出血点附近脑组织中ESM-1呈低表达水平，且ESM-1可以反映脑出血患者病情严重程度，这可能提示血管内皮自我修复能力降低。既往研究显示，缺氧诱导因子-1α/VEGF通路可调控ESM-1从而增强单核细胞对血管内皮细胞的黏附作用，高水平的ESM-1对血管损伤有修复作用，而ESM-1水平较低则不利于血管修复[16-17]，与本研究结论相似。此外，本研究结果显示，脑出血点附近脑组织的ESM-1 mRNA表达量预测脑出血患者预后不良的AUC为0.842，说明ESM-1对脑出血患者预后有一定预测价值。以上研究结果均提示ESM-1在脑出血中扮演重要角色，ESM-1可能成为治疗急性脑出血的新靶点。

Vaspin是一种抗炎因子，主要参与脂质代谢和胰岛素抵抗过程。在血管内皮中，Vaspin可以降低血管内皮功能障碍，通过抑制炎症反应保护血管内皮[18]。高荣华等[19]研究发现，当血清Vaspin水平低于0.57 ng/mL时，提示急性心肌梗死患者冠状动脉支架植入术后发生心血管不良事件风险较大，表明低表达量的Vaspin与急性心肌梗死患者机体的炎症反应增强相关。本研究结果显示，对照组Vaspin蛋白阳性表达率及mRNA表达量均高于脑出血组，且轻型组、小量出血组脑出血点附近脑组织中的Vaspin蛋白阳性表达率分别高于重型组、大量出血组(均P<0.05)，说明Vaspin可能参与脑出血的形成过程，其表达水平与脑出血患者病情严重程度有关。原因可能是：Vaspin表达量越低，对血管修复作用越弱，患者病情越严重，血管壁及脑组织破坏越严重。Zhou等[20]研究发现，Vaspin可以增强内皮细胞与细胞外基质的黏附，增加血管黏附力和抗剪切力。本研究结果显示，脑出血点附近脑组织的Vaspin mRNA表达量预测脑出血患者预后不良的AUC为0.896，敏感度为83.30%，特异度84.30%，说明Vaspin对脑出血患者预后有一定预测价值。此外，本研究相关分析结果显示，脑出血点附近脑组织的ESM-1 mRNA与Vaspin mRNA表达量呈正相关，我们推测ESM-1与Vaspin共同维持血管内皮细胞完整性。ESM-1 mRNA表达量、Vaspin mRNA表达量联合预测脑出血患者预后的AUC为0.947，敏感度、特异度为91.70%、83.20%，提示ESM-1、Vaspin联合预测脑出血患者预后具有较大的参考价值。

综上所述，ESM-1、Vaspin在脑出血患者脑出血点附近脑组织中呈低表达，二者共同参与脑出血的发生，且与脑出血严重程度密切相关，二者联合预测脑出血患者预后的价值较高。