青少年2型糖尿病人群代谢相关脂肪性肝病与肠道菌群的相关性研究

陈思劼，蔡舒婷，徐静，陈雅娟，陈斌斌，陈晓莉，熊红萍，2

1.厦门大学附属福州第二医院内分泌科，福建福州 350007；2.福建医科大学第三临床医学院，福建福州 350007；3.福建中医药大学第一临床医学院，福建福州 350122

代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease, MAFLD）是一种遗传易感、环境因素和代谢紊乱相互作用导致的慢性肝病，其患病率逐年上升，累及全球约25%的人口[1]。糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、内脏型肥胖等代谢因素被认为是与MAFLD 关系最为密切的危险因素，同时也是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）的临床特征，故MAFLD 与T2DM 共病率较高。研究显示，在全球T2DM 人群中MAFLD 的患病率高达47.3%～63.7%[2]。肠道菌群能够参与动态调节人体能量稳态和免疫反应。当遗传、环境因素、饮食和行为模式发生改变后，人体内肠道菌群可能发生漂移。近年来不断有研究发现T2DM 和NAFLD 患者伴有肠道菌群漂移表现[3]。青少年T2DM 中合并MAFLD的患者逐年增多，但这部分人群的肠道菌群漂移特点尚未明确。因此，本研究回顾性选取2020年10月—2021年7月就诊于厦门大学附属福州第二医院内分泌科并接受肝脏彩超的青少年2 型糖尿病患者44 例为研究对象，按照是否合并代谢相关脂肪性肝病分为非MAFLD 组和MAFLD 组，比较两组人群的肠道菌群，旨在探讨青少年T2DM 人群中MAFLD 与肠道菌群数量的关系。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取于本院内分泌科接受肝脏彩超的青少年2型糖尿病患者44 例为研究对象，根据MAFLD 诊断标准[1]，将其中不符合MAFLD 诊断的18 例患者设为非MAFLD 组，符合MAFLD 诊断的26 例患者设为MAFLD 组。本研究经本院伦理委员会批准（No.2020018），所有对象均知情同意。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①符合《中国2 型糖尿病防治指南（2020年版）》[4]的诊断及分型标准；②年龄14～40岁，性别不限；③临床资料完整，知情同意。

排除标准：①妊娠或哺乳期女性；②糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等急性并发症患者；③急、慢性感染患者；④急性心脏、肝脏、胃肠道、肾脏及脑血管病变患者；⑤半年以内严重外伤、手术者；⑥恶性肿瘤、临床结缔组织疾病等患者；⑦其他严重内分泌代谢性疾病患者（如甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、库欣综合征等）。

1.3 方法

所有患者就诊时采集其清晨粪便样本，将新鲜粪便样本（10±5） g 于2 h 内速冻于-80℃冰箱中。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒进行基因组抽提样本中微生物的总DNA，将所提取的DNA 为模板，根据菌群16 S rRNA V4V5 序列设计各类菌种特异性引物，引物序列见表1。采用FTC-3000 荧光定量PCR 仪（加拿大Funglyn Biotech 公司）对肠道中常见几种细菌进行定量测定，反应条件：95℃预变性30 s，在95℃变性10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循环40 次。荧光数据采集在延伸时进行。每个粪便标本均测量3 次，取平均CT 值，根据标准曲线计算该菌属基因拷贝数，并经Log10 转化后表示每克粪便肠道菌属的数量。

表1 各类菌种特异性引物序列

收集所有患者：①人体学指标：身高、体质量、腹围，计算身体质量指数（body mass index, BMI）=体质量/身高2（kg/m2）；②生化代谢指标：空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、餐后2 h 血糖（2 h postprandial plasma glucose, 2 hPG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin, HbA1c）、三酰甘油（triglycerides, TG）、总胆固醇thosetotal cholesterol, TC）、高密度脂蛋白胆固醇（thosehigh-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、尿 酸（serum uric acid, SUA）、肌酐；③炎症指标：中性粒细胞淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、血小板淋巴细胞比值（platelet-lymphocyte ratio, PLR）；④甲状腺功能：促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）、游离三碘甲状原氨酸（free triiodothyronine, FT3）、游离甲状腺激素（free thyroxine, FT4），通过问卷收集吸烟史、饮酒史、糖尿病家族史。

1.4 观察指标

①对比两组一般资料、人体学指标、生化代谢指标、炎症指标及甲状腺功能水平；②对比两组肠道主要菌群数量；③肠道菌群与相关临床指标的相关分析；④肠道菌群与MAFLD 的相关性分析。

1.5 统计方法

采用SPSS 24.0 统计学软件进行分析数据。使用Shapiro–Wilk 检验进行正态性检验，符合正态分布的计量资料采用（±s）表示，组间差异比较进行t检验；计数资料采用率（%）表示，组间差异比较进行单因素ANOVA 检验分析或χ2检验分析。采用Pearson 相关性分析进行肠道菌群与人体学指标、糖脂代谢指标等相关性分析。采用Logistics 回归分析青少年T2DM 患MAFLD 的独立危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料、人体学指标、生化代谢指标、炎性指标及甲状腺功能比较

两组性别、饮酒史、糖尿病家族史比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；MAFLD 组年龄较非MAFLD组小，差异有统计学意义（P＜0.05）。人体学指标方面，MAFLD 组BMI、腹围均大于非MAFLD 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。生化代谢指标方面，MAFLD 组HDL-C 低于非MAFLD 组，血尿酸水平高于 非MAFLD 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MAFLD 组FPG 及2 hPG 水平均高于非MAFLD 组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。两组NLR、PLR 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），MAFLD 组TSH 水平高于非MAFLD 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组一般资料、人体学指标、生化代谢指标、炎性指标及甲状腺功能比较

2.2 两组肠道主要菌群数量比较

MAFLD 组的柔嫩梭菌属和双歧杆菌属数量明显均低于非MAFLD 组，肠球菌属和乳酸菌属数量明显均高于非MAFLD 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组肠道主要菌群数量对比 (±s)

表3 两组肠道主要菌群数量对比 (±s)

菌群菌群总量（16S V4V5）肠球菌属大肠杆菌属厚壁菌门拟杆菌属柔嫩梭菌属乳酸菌属双歧杆菌非MAFLD 组（n=18）11.158±0.339 6.681±0.854 8.112±0.882 10.234±0.324 10.259±0.465 9.448±0.739 6.514±1.032 7.354±1.134 MAFLD 组（n=26）11.052±0.364 7.268±1.014 7.854±1.248 10.038±0.546 9.872±0.907 8.764±0.687 7.106±0.700 6.513±0.753 t 值0.978-2.007 0.755 1.363 1.662 3.145-2.267 2.960 P 值0.334 0.045 0.455 0.180 0.104 0.003 0.043 0.010

2.3 肠道菌群与代谢相关临床指标的关系

将两组间有统计学差异的肠道菌群与代谢相关临床指标行Pearson 相关性分析。结果显示，肠球菌属数量与腹围呈正相关；柔嫩梭菌属数量与腹围、血尿酸水平、NLR 呈负相关（P＜0.05）；乳酸菌属数量与腹围、糖化血红蛋白、低密度脂蛋白胆固醇呈正相关（P＜0.05）；双歧杆菌与腹围、NLR、BMI 呈负相关（P＜0.05）。见表4。

表4 肠道菌群与临床指标关系

2.4 青少年2 型糖尿病肠道菌群与代谢相关脂肪性肝病的关系

为探究肠道菌群数量与青少年T2DM 发生MAFLD 的相关性，以MAFLD 为因变量，将两组间有统计学差异的肠道菌群为自变量，逐个纳入Logistics 回归分析。结果提示，柔嫩梭菌、双歧杆菌数量减少，乳酸菌属数量增加，青少年T2DM 发生MAFLD 的概率增加。见表5。进一步进行多因素Logistics 回归分析，在调整了年龄、性别、是否新诊断糖尿病、BMI 后，柔嫩梭菌属和双歧杆菌属仍是青少年T2DM 发生MAFLD 的独立保护因素（P＜0.05）；即肠道中柔嫩梭菌和双歧杆菌数量增加，青少年T2DM 发生MAFLD 的概率降低。见表6。

表5 青少年T2DM 肠道菌群数量与MAFLD 关系

表6 影响青少年T2DM 发生MAFLD 多因素分析

3 讨论

T2DM 对人体的主要危害在于其长期慢性高血糖状态对靶器官的损害，其中MAFLD 是T2DM 发生肝脏损害的主要形式[5]。近年来有研究表明，肠道菌群能通过调节宿主能量代谢、改善炎症反应等方式，参与T2DM、MAFLD 等多种代谢性疾病的发生和发展过程[6-8]。本研究通过比较青少年T2DM 中MAFLD 患者与非MAFLD 患者的临床特点及肠道菌群的差异，探索青少年T2DM 患者肠道菌群数量与MAFLD 的关系。研究结果表明，柔嫩梭菌属和双歧杆菌属是青少年T2DM 发生MAFLD 的独立保护因素，且不受年龄、性别、病程和其他混杂因素的影响。

柔嫩梭菌是厚壁菌门的主要成员，是健康人肠道中丰度最高的菌群之一，它的缺失必然引起肠道微生态的紊乱[9]。近年来多项研究表明，柔嫩梭菌对于人体健康的益处来源于其产生的丁酸盐，它的丰度变化与溃疡性结肠炎、克罗恩病等肠道炎性疾病密切相关[10]。柔嫩梭菌可在外周血单核细胞中诱导白细胞介素-10(interleukin, IL-10)分泌，后者是一种抗炎细胞因子[11]。Munukka 等[12]的研究表明，与高脂饮食对照小鼠相比，高脂饮食+口服柔嫩梭菌群的小鼠肝脏脂肪含量、天冬氨酸转氨酶及丙氨酸转氨酶降低，其机制与内脏脂肪组织中脂联素表达上调，皮下及内脏脂肪组织对胰岛素敏感性增加且炎症减少相关。此外，本研究还发现，柔嫩梭菌在MAFLD 人群中数量更少，且其与血尿酸及NLR呈负相关，前者可使线粒体发生氧化应激，激活NLRP3 炎症复合体，加重肝脏炎症反应及胰岛素抵抗，而后者反映机体整体的炎症状态，当NLR 增加时，MAFLD 患者发生肝炎和肝纤维化的可能性更大。Martín R 等[13]从健康志愿者的粪便中分离出柔嫩梭菌菌株，通过研究其产物、抗生素耐药性、免疫调节功能及代谢特征，发现其具有良好的抗炎作用，是下一代益生菌的良好候选者。

双歧杆菌是目前主要使用的益生菌之一，已经发现并测序出72 种亚种，它们在肠道功能乃至人体稳态方面发挥着重要作用[14]。一项研究通过肥胖并伴有T2DM 患者的十二指肠微生物群进行宏基因组分析，揭示了肥胖、肥胖伴有T2DM 患者，双歧杆菌属丰度显著低于健康个体[15]。另一项研究通过多组学方法，分析4 株人体肠道共生双歧杆菌（双歧杆菌PRL2010、青春双歧杆菌22L、短双歧杆菌12L、长双歧杆菌亚种）在小鼠肠道内的相互作用[16]。研究表明，双歧杆菌之间通过多糖获取、多糖降解及互养策略在竞争性环境下合作共生，多株双歧杆菌地引入导致小鼠盲肠菌群组成发生显著变化，增加了糖降解菌群，如拟杆菌的丰度，从而增强肠道降解植物碳水化合物及宿主多糖的能力。动物研究表明，由乳杆菌与双歧杆菌联合的益生菌可以延缓高脂饮食诱导的NAFLD 病变，大鼠的体质量、血清FFA、TG、ALT、IL-1β 和IL-18 水平显著降低，肝脏和脂肪组织中Gpr109a 的表达显著降低，丁酸水平显著增加[17]。上述研究提示，双歧杆菌与肥胖、低度炎症、胰岛素抵抗和糖代谢紊乱呈负相关。本研究发现MAFLD 患者中双歧杆菌数量更少，且与腹围、NLR 呈负相关（P＜0.05），但与糖代谢指标（FPG、2 hPG、HAb1c）无显著相关性（P＞0.05）。

尽管不是青少年T2DM 患MAFLD 的独立危险因素，研究观察到MAFLD 患者中肠球菌和乳酸杆菌的数量更多。肠球菌是检出率仅次于大肠杆菌的第二大病原菌，当机体大量使用抗生素或免疫力下降时，肠球菌会易位进入其他组织器官，造成机体感染。Llorente C 等[18]的研究基于小鼠模型和人体数据，发现质子泵抑制剂可通过增加肠道肠球菌的数量及促进肠球菌的易位，导致肝脏炎症及肝细胞死亡。有趣的是，作为益生菌之一，多项研究观察到，乳酸杆菌与肥胖呈正相关[19-21]。目前也有研究发现乳酸杆菌属益生菌（如鼠李糖乳杆菌GG）通过与宿主肠道竞争脂肪酸，抑制小鼠肠道中的脂肪酸代谢及吸收，从而抑制肝脏脂肪堆积，以此机制预防脂肪肝的发生[22]。由于乳酸杆菌是T2DM 和MAFLD 患者共有的特征菌群，其对这两种代谢疾病发挥作用的相关机制还需进一步探讨。

另外，本研究发现，尽管在青少年T2DM 中，合并MAFLD 的患者年龄更小[（35.440±7.262）岁 vs（29.150±7.341）岁]（P＜0.05），这可能与青少年T2DM患者存在学习、事业、家庭等多重负担，生活、饮食、睡眠习惯更差有关，增加了代谢紊乱的风险。虽无统计学差异，本研究发现青少年T2DM 人群中，男性MAFLD 患病率比女性更高。既往研究表明，MAFLD 在男性的患病率高于绝经前女性，而在绝经后相反，可能与体内雌激素水平相关[23]。雌激素可以通过调节情绪和能量稳态、调整脂肪组织功能及分布、抑制炎症因子生成和改善胰岛素抵抗等机制，阻止肝脏的脂肪变性。

本研究还发现甲状腺功能正常的青少年T2DM患者中，TSH 水平和MAFLD 患病相关。一项横断面研究表明，在HbA1c≥7%的T2DM 人群中，TSH 升高不仅与MAFLD 患病率相关，还与MAFLD 脂肪变性程度相关[24]。已有的研究对于TSH 升高导致MAFLD 的机制做了说明：TSH 可作用于激素敏感性三酰甘油脂肪酶和脂肪甘油三酯脂肪酶这两个脂肪分解的关键酶，促进脂肪细胞的分化，从而抑制脂肪组织的分解；此外，TSH 通过调节肝细胞内固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding proteins, SREBP-1c)的表达活性，达到增加三酰甘油合成的目的[25]。

但本研究仍存在一些局限性：①研究样本数量小，研究结果存在地域限制；②没有详细的用药史，不能排除降糖药物对肠道菌群的影响；③由于本研究的性质为回顾性分析，肠道菌群与青少年T2DM人群患MAFLD 之间的因果关系尚不能确定。因此，后续可以在大样本量的基础上设计多中心前瞻性研究，并在进一步研究中收集可能影响肠道菌群的用药史。

综上所述，青少年T2DM 中MAFLD 患者与非MAFLD 患者的肠道菌群存在差异，表现为柔嫩梭菌和双歧杆菌数量偏低，肠球菌和乳酸杆菌数量偏高。肠道菌群的变化和患者糖脂代谢、肥胖表型、炎症水平密切相关。在排除了相关混杂因素以后，柔嫩梭菌和双歧杆菌仍是青少年T2DM 发生MAFLD 的独立保护因素。这提示调节相应肠道菌群，将有助于青少年T2DM 人群中MAFLD 的防治。