紫娟茶中甲基化儿茶素提取工艺优化

李宇倩 高创创 李明超 李晓蕾 郝 倩

(1. 昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500； 2. 昆明理工大学分析测试研究中心，云南 昆明 650500)

紫娟茶是一种芽、叶、茎均为紫色的茶树品种，为普洱茶的一个重要变种[1]。紫娟茶具有明显的降压及抗敏作用[2]，且含有丰富的化学成分，如儿茶素类[3-4]、花青素类[5]、色素[6]及微量元素[7]等。前期研究[8]表明，紫娟茶中含有甲基化儿茶素类成分。甲基化儿茶素是最早被日本科学家[9]从绿茶品种Benihomare中分离得到，是具有显著抗过敏、消炎、降血压等效果的新型化合物[10]。Sano等[11-12]分别从台湾冻顶乌龙、绿茶Benihomare中先后分离得到EGCG3"Me和EGCG4"Me，且EGCG3"Me在动物血液中的稳定性显著高于未甲基化的EGCG，其口服吸收率约为EGCG的9倍[13]，这可能是由于甲基化后的儿茶素脂溶性增加，总体脂溶量和吸收率均高于正常儿茶素，其生物利用度也有很大程度提高[14]。此外，茶树秋冬季鲜叶中的甲基化儿茶素含量高于春夏季，且随叶片成熟度的提高而升高[15]。吕海鹏等[16]研究表明紫娟茶第三叶的EGCG3"Me成分含量最高并达到1.24%。目前关于儿茶素提取工艺优化的研究多以提取时间、提取温度、溶液含水率等为影响因素，通过响应面法对儿茶素提取工艺进行优化[17-18]。但有关甲基化儿茶素的提取工艺研究甚少[13]。

试验前期，从云南产紫娟茶中分离得到的两个甲基化儿茶素EGCG3"Me和ECG3"Me结构如图1所示。试验拟采用HPLC和响应面分析法优化紫娟茶中甲基化儿茶素成分的提取工艺，采用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析并建立分析模型，明确提取时间、提取温度和料液比3个因素对紫娟茶中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)提取质量分数的交互影响，以期为该茶树品种开发新功能性饮料及保健食品的发展提供依据。

图1 EGCG3"Me和ECG3"Me结构

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

紫娟茶：2010年，产地云南邦东；

EGCG3"Me、ECG3"Me标准品：纯度为95%，昆明理工大学云南省高校靶点药物筛选与利用重点实验室自制；

无水甲醇、无水乙醇：分析纯，天津致远化学试剂有限公司；

三氟乙酸：分析纯，重庆川东化学试剂厂；

乙腈：色谱纯，美国BCR试剂公司；

电子天平：CP64C型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

高效液相色谱：U-3000型，戴安(中国)有限公司；

电热恒温水浴锅：SB-1200型，上海爱朗仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准样品制备及标准曲线绘制 参照孙业良等[13-14,19-20]的方法。HPLC条件：Welchrom C18色谱分析柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；乙腈(A)—50 mmol/L磷酸(B)为流动相，4%～100%梯度洗脱，洗脱时间60 min，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，波长280 nm。

1.2.2 精密度试验 取混合标准品液6份，按1.2.1的HPLC条件分别进样6次，计算EGCG3"Me和ECG3"Me峰面积的相对标准偏差(RSD)。

1.2.3 重复性试验 选取供试品溶液6份，按1.2.1的HPLC条件连续进样6次，计算EGCG3"Me和ECG3"Me峰面积。

1.2.4 稳定性试验 选取供试品溶液1份，配制后避光冷藏0，2，4，6，8，12 h，按1.2.1的HPLC条件进样，计算EGCG3"Me和ECG3"Me的RSD值。

1.2.5 回收率试验 选取已确定浓度的含有EGCG3"Me的样品6份，各加入0.1 mg EGCG3"Me标品，按样品质量分数测定方法进行处理和测定；取已确定浓度的含有ECG3"Me的样品6份，加入0.1 mg ECG3"Me标准品，按样品质量分数测定方法处理和测定，计算样品的平均加样回收率。

1.2.6 单因素试验

(1) 提取溶剂：准确称取1.00 g紫娟茶样品，浸泡于50 mL溶液中，分别以酸性甲醇(1% TFA)、酸性乙醇(1% TFA)、水、酸性水(1% TFA)、酸性甲醇水(1% TFA)、酸性乙醇水(1% TFA)为提取溶剂， 60 ℃提取60 min，重复提取3次，取上清经微孔滤膜后进行HPLC分析，考察提取溶剂对浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的影响。

(2) 提取时间：精确称取1.00 g紫娟茶样品，浸泡于50 mL溶液中，以酸性乙醇(1% TFA)为溶剂，60 ℃下分别提取20，40，60，80，100，120 min，重复提取3次，取上清经微孔滤膜后进行HPLC分析，考察提取时间对浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的影响。

(3) 提取温度：精确称取1.00 g紫娟茶样品，浸泡于50 mL溶液中，以酸性乙醇(1% TFA)为溶剂，提取温度分别为30，40，50，60，70，80 ℃，提取时间为100 min，重复提取3次，取上清液经微孔滤膜过滤后进行HPLC分析，考察提取温度对浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的影响。

(4) 料液比：精确称取1.00 g紫娟茶样品，以酸性乙醇(1% TFA)为溶剂，料液比分别为(m紫娟茶∶V溶剂)1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)，70 ℃提取100 min，重复提取3次，取上清液经微孔滤膜过滤后进行HPLC分析，考察料液比对浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的影响。

1.2.7 响应面试验优化 参照高晶晶等[21]的方法，根据单因素试验结果确定响应面试验的因素水平取值，采用Box-Behnken设计，以浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数为响应值，优化紫娟茶中甲基化儿茶素提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 紫娟茶中甲基化儿茶素含量HPLC分析方法的建立

2.1.1 标准曲线制作 以不同浓度梯度ECG3"Me和EGCG3"Me两个标品的HPLC峰面积作纵坐标，两个标品浓度 (mg/mL) 为横坐标，计算标准曲线线性回归方程分别为Y=3 204.94X-36.94，Y=2 911.45X-25.65，且两种标品在0～3 mg/mL时，质量浓度与峰面积表现出显著线性关系，其R2分别为0.999 60和0.999 86。

2.1.2 精密度试验 经测定，EGCG3"Me和ECG3"Me峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.43%，1.59%，均在2%之内，说明试验方法的精密度良好。

2.1.3 重复性试验 经测定，EGCG3"Me和ECG3"Me峰面积的RSD分别为0.49%，1.48%，均在2%之内，说明此方法的重复性良好。

2.1.4 稳定性试验 经测定，EGCG3"Me和ECG3"Me峰面积的RSD值分别为0.48%，1.58%，说明供试品的溶液在12 h内稳定。

2.1.5 回收率试验 通过回收率试验的考察，样品的平均加样回收率分别为94.5%，92.5%，说明该方法有较好的回收率。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取溶剂 由图2可知，以酸性乙醇为提取溶剂时，浸提液中EGCG3"Me质量分数达最大值；以酸性甲醇为提取溶剂时，浸提液中ECG3"Me质量分数达最大值。从甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)的提取质量分数来看，酸性乙醇的提取质量分数可达14.755 mg/g，70%酸性甲醇的次之，水溶剂提取的最小。因此试验选取酸性乙醇作为提取溶剂。酸性乙醇中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)提取质量分数最高，可能是因为甲基化儿茶素比非甲基化儿茶素的脂溶性更强。

2.2.2 提取时间 由图3可知，随着提取时间的延长，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数均先变大后减小，且均在100 min时达最大值，此时甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数为5.663 mg/g。因此选取100 min为最佳提取时间。这可能是甲基化儿茶素起初会随时间的延长，浸出物增加，呈上升趋势，经过一段时间的累积，甲基化儿茶素的浸出量接近饱和，且甲基化儿茶素会随着时间的延长存在部分降解的现象，从而呈下降趋势。

图3 提取时间对甲基化儿茶素质量分数的影响

2.2.3 提取温度 由图4可知，随着提取温度的升高，物质扩散系数增大，浸出量增大，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数均增加，当提取温度>60 ℃时，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数上升趋势均趋于平缓当提取温度为60 ℃时，甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数为15.467 mg/g；当提取温度为70 ℃时，甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数为17.177 mg/g，提取质量分数明显提高；当提取温度为80 ℃时，甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数为19.605 mg/g，虽然有增长的趋势但较平缓，且乙醇的沸点为78.5 ℃，随着提取温度的升高，乙醇会因沸腾而造成挥发，影响溶剂对紫娟茶的浸提作用。因此，确定最佳的提取温度为70 ℃。

图4 提取温度对甲基化儿茶素质量分数的影响

2.2.4 料液比 由图5可知，随着料液比的增加，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数上升，且当料液比(m紫娟茶∶V溶剂)>1∶70 (g/mL)后上升趋势较平稳。但就甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数来看，当料液比(m紫娟茶∶V溶剂)为1∶10～1∶70 (g/mL)，甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数逐渐升高，当料液比(m紫娟茶∶V溶剂)为1∶70～1∶90 (g/mL)时，甲基化儿茶素质量分数虽有增高但趋于平缓，考虑其经济效益，选择1∶70 (g/mL)作为最优料液比。

图5 料液比对甲基化儿茶素质量分数的影响

2.3 响应面分析法优化工艺结果

2.3.1 响应面模型构建 基于单因素试验结果，选取提取时间、提取温度和料液比为试验因素，以浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件辅助设计三因素三水平的响应面分析试验。试验因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 响应面因素水平

对表2试验数据进行多元回归分析，经拟合得到甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的二次多项回归方程为：

表2 响应面试验设计方案及结果

(1)

表3 回归方程的方差分析†

2.3.3 响应面曲面分析 由图5可知，提取时间与料液比交互作用的曲面相对较陡，因此提取温度对用酸性乙醇提取甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的影响显著性最强；料液比对甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数的影响次之。在图6(b)和图6(d)中，随提取时间增加儿茶素质量分数呈现先增大后减小的趋势，提取时间在110 min左右出现最大值；在图6(d)和图6(f)中，随着料液比增大儿茶素质量分数先快速增加后趋于平缓；在图6(b)和图6(f)中，随着提取温度升高儿茶素质量分数呈现先增大后减小的趋势，提取温度在75 ℃左右出现最大值。根据响应面优化模型可预测紫娟茶中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)提取的最优条件为以酸性乙醇为提取溶剂，提取时间100 min、提取温度75 ℃、料液比(m紫娟茶∶V溶剂)1∶74 (g/mL)，此时浸提液中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数理论值为27.1 mg/g。

图6 各因素交互作用的等高线和响应面图

2.3.4 验证实验 根据响应面优化所得最优提取条件进行3次平行实验，测定浸提液中EGCG3"Me质量分数平均值为13.4 mg/g，ECG3"Me质量分数平均值为13.3 mg/g，甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数平均值为26.7 mg/g。甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)质量分数与理论预测值的相对误差为1.48%，说明该回归模型优化的工艺组合是有效的。

3 结论

建立了紫娟茶中甲基化儿茶素含量的HPLC分析方法，并对其提取工艺进行了优化。结果表明，紫娟茶中甲基化儿茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)的最优提取工艺为以酸性乙醇为提取溶剂，提取时间100 min、提取温度75 ℃、料液比(m紫娟茶∶V溶剂)1∶74 (g/mL)，此时甲基化儿茶素质量分数为26.7 mg/g，与理论预测值的相对误差为1.48%。后续考虑对甲基化儿茶素的药理作用进行研究，分析不同位点的甲基化对儿茶素的药理作用的影响，并研究不同药理作用形成的原因。