壮肾固精方治疗IgA肾病的网络药理学机制

王艾琳， 刘立昌， 刘旭生， 刘新

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510006；2.广东省中医院珠海医院，广东珠海 519015）

IgA肾病（IgA nephropathy）是以血尿、蛋白尿、水肿、高血压为主要临床表现的原发性肾小球疾病，在我国的发病率较高，占原发性肾小球疾病的45%～50%。本病并非良性病变，超过1/3的IgA肾病患者发病20年后发展至终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD），是引起我国青年患者肾衰竭的常见病因[1]。目前，西医临床主要是应用血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素受体阻滞剂（ARB）类药物控制血压，减少尿蛋白，稳定肾功能进展，对疗效欠佳者可应用糖皮质激素或联合免疫抑制剂治疗，但激素及免疫抑制剂治疗IgA肾病的同时往往带来一些副作用。而中医药在IgA肾病的防治中发挥了重要作用，具有增强疗效、改善肾功能、缓解症状、降低激素毒副作用等优势。中医学根据不同症状将IgA肾病归为“尿血”“尿浊”“水肿”等范畴。本病为本虚标实、虚实夹杂之证，本虚主要指脾肾气虚、肝肾阴虚、气阴两虚等，标实主要指热毒、湿热、瘀血。广州中医药大学第二临床医学院刘新主任医师在多年的临床实践中，对各家研究成果及个人经验进行总结和归纳，创制以补肾健脾、活血固精、清热利湿为组方原则的壮肾固精方，该方由黄芪、黄精、金樱子、菟丝子、覆盆子、水蛭、野荞麦根等中药组成。本课题组前期临床观察初步证实壮肾固精方可有效降低蛋白尿和血尿水平[2-4]。为进一步明确壮肾固精方治疗IgA肾病的作用机制以推广临床应用，故借助网络药理学方法进行分析预测。网络药理学结合了网络生物学和多项药理学，依托组学和大数据高速发展，能高效准确地预测中药复方中的活性成分、作用靶标并发现其作用机制，从分子水平上阐述“病证”与“方药”的关系[5]，为临床使用中医药治疗疾病奠定理论基础。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 搜集壮肾固精方活性成分与作用靶点首先在TCMSP数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中分别检索壮肾固精方中的“黄芪”“黄精”“金樱子”“菟丝子”“覆盆子”“野荞麦根”，获取这些药物的活性成分。应用TCMID数据库（http://www.megabionet.org/tcmid/）和SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预 测 出“水蛭”的相应指标。按照口服生物利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18的标准对所获取的药物活性成分进行筛选，得到这些药物的有效化学成分以及有效成分相对应的作用靶点。然后应用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）对上述方法得到的药物作用靶点名称进行转换，得到相对应的基因名。最后，通过Cytoscape 3.8.0生物信息分析软件构建成分-靶点网络图，并进行拓扑分析。

1.2 搜集壮肾固精方治疗IgA肾病的相关靶点在OMIM数据库（https://www.omim.org/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）及PharmGkb数据库（https://www.pharmgkb.org/）中搜索关键词“IgA nephropathy”（IgA肾病），获得与IgA肾病相关的靶点。以上3个数据库为使用率较高的人类疾病基因综合检索数据库。然后使用半编程性质的脚本性软件Rproject对3个数据库搜集到的本疾病相关靶点进行剔重和汇总，并对壮肾固精方药物靶点与IgA肾病相关靶点进行映射，构建Venn图。

1.3 构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络与分析

将上述方法得到的相关基因导入STRING数据库（http://stringdb.org），设定物种（Organism）为人类（Homosapiens），获得PPI网络，设置最高置信程度（highest confidence：0.9）作为筛选条件，导出.tsv格式文件，然后将其导入Cytoscape 3.8.0软件，根据度（degree）值的排序得到排名前5位的基因，用CytoNCA组件筛选出PPI网络中10个核心基因。

1.4 分析重要靶点的基因功能和信号通路使用R project软件中的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和ggplot2包对壮肾固精方治疗IgA肾病的重要靶点进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，将富集分析得到的结果以条形图和气泡图形式予可视化展示。

2 结果

2.1 壮肾固精方活性成分的筛选在TCMSP、TCMID数据库及SwissTargetPrediction数据库中，根据OB＞30%、DL＞0.18的标准共筛选出57个活性成分，其详细信息见表1所示。

表1 壮肾固精方活性成分的筛选结果Table 1 Screening results of active ingredients in Zhuangshen Gujing Prescription

2.2 壮肾固精方活性成分-靶点网络使用Cytoscape 3.8.0软件构建成分-靶点网络图（见图1），并进行网络拓扑分析。结果显示：成分-靶点网络图共包含138个节点，335条边；度值前5位的活性成分为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）、刺芒柄花素（formononetin）；度值前5位的靶点为PTGS2、PTGS1、PRSS1、DPP4、ESR1。

图1 壮肾固精方活性成分-靶点网络Figure 1 Ingredient-target network of Zhuangshen Gujing Prescription

2.3 壮肾固精方治疗IgA肾病相关靶点的筛选在OMIM数据库、GeneCards数据库及PharmGkb数据库中检索得到与IgA肾病相关的靶点1 213个。使用R project软件对壮肾固精方药物靶点与IgA肾病相关靶点进行映射，取交集后构建韦恩（Venn）图（见图2），共 获 得CDK2、ESR1、RELA、VEGFA、CDKN1A、MMP2、MMP9、NFKBIA、CXCL8、GSTP1、GSTM1、PTGS2、DPP4、PTGS1、ADRB2、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、NOS2、PPARG、PRSS1、IKBKB、AKT1、MAPK8、MMP1、STAT1、CDK1、HMOX1、CYP3A4、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、ALOX5、SLPI、AKR1B1、MMP3、EGFR、CCND1、BCL2L1、FOS、PLAU、MAPK1、IL10RA、EGF、RB1、TP53、SOD1、HIF1A、HSPA5、ERBB2、CAV1、MYC、F3、IL1B、CCL2、NOS3、HSPB1、IL2RB、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、IFNG、IL1A、MPO、NQO1、PARP1、PPARA、CXCL10、CHUK、SPP1、RUNX2、E2F1、CD40LG、DPEP1、CYCS、G6PD、MAPK14、ADH1B、HPSE、CD44等87个交集基因。

图2 壮肾固精方治疗IgA肾病靶点的韦恩（Venn）图Figure 2 The Venn graph of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

2.4 壮肾固精方治疗IgA肾病的PPI网络为了更全面地认识壮肾固精方治疗IgA肾病的作用机制，将“2.3”项所得的疾病与药物的交集靶点输入STRING数据库，构建靶标PPI网络（见图3）。网络中共包含79个节点，301条边。导出.tsv格式文件，然后将其导入Cytoscape 3.8.0软件，根据度值的排序得到排名前5位的基因为PTGS2、PTGS1、PRSS1、DPP4、ESR1。利用CytoNCA组件筛选出PPI网络中的核心基因，分别为TP53、AKT1、JUN、MAPK1、RELA、MAPK14、ESR1、MYC、MAPK8、FOS。见图4。

图3 壮肾固精方治疗IgA肾病的PPI网络Figure 3 The PPInetwork of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

图4 PPI网络中的核心基因Figure 4 Core genes of PPInetwork

2.5GO功能富集分析与KEGG通路富集分析GO富集分析的结果显示：生物学过程（biological process，BP）主要与细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）有关；细胞组件（cellular component，CC）主 要 与 薄 膜 筏 子（membrane raft）、微域膜（membrane microdomain）有关；分子功能（molecular function，MF）主要与DNA结合的转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）有关。KEGG富集分析结果显示壮肾固精方治疗IgA肾病可能与丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）、核因子kappa B信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、Janus激酶-信号转导子和转录激活子信号通路（JAK-STAT signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、白细胞介素17信号通路（IL-17 signaling pathway）等有关。具体结果见图5～图6。

图5 壮肾固精方治疗IgA肾病靶点的GO功能富集分析Figure 5 GO enrichment analysis of targets of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

图6 壮肾固精方治疗IgA肾病靶点的KEGG富集分析Figure 6 KEGG enrichment analysis of targets of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

3 讨论

IgA肾病属于自身免疫性疾病，主要表现为IgA亚型的异常表达。缺乏半乳糖型IgA（Gd-IgA1）是一种可以与IgG或IgA1形成免疫复合物的抗聚糖自体抗体。形成的复合物沉积在肾小球系膜上，刺激系膜细胞增殖并促进细胞因子的聚集，继而导致足突细胞基因表达和肾小球渗透性阻力指标的变化，逐渐发展为肾小球硬化和间质纤维化，并伴有肾功能受损，最终出现终末期肾脏病[6]。根据全球肾脏病预后组织（KDIGO）指南，目前IgA肾病的治疗方案主要为抗蛋白尿和抗高血压治疗及应用糖皮质激素、免疫抑制剂和鱼油[7]。对于高风险的患者，通常需要联合使用糖皮质激素和免疫抑制剂。然而，这种治疗方案会对患者机体造成较大损伤[8]。经过前期的临床观察，我们发现壮肾固精方可以有效减轻IgA肾病患者的蛋白尿和血尿水平，壮肾固精方联合常规治疗可以有效降低患者的毒副作用，但其治疗机制尚不明确。

本研究通过步骤“2.2”项得到了有效成分-靶基因网络，并进行拓扑分析，得到度值前5位的有效成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、刺芒柄花素。其中，槲皮素是菟丝子、金樱子、金荞麦、覆盆子、黄芪的共同有效成分，木犀草素是金荞麦的有效成分，山柰酚是菟丝子、金樱子、覆盆子、黄芪的共同有效成分，黄芩素是黄精的有效成分，刺芒柄花素是黄芪的有效成分。研究发现，槲皮素具有很好的抗炎作用，可以调节巨噬细胞极化，保护肾小球足细胞，从而改善肾脏损伤，还可以抑制NF-κBp65和Toll样受体2（TLR2）蛋白的表达，以减轻肾脏氧化应激，延缓肾功能衰竭[9-11]。木犀草素能通过降低细胞内钙离子浓度抑制肾动脉收缩，扩张已收缩的肾动脉，降低血压，可联合其他药物治疗IgA肾病进展过程中发生的高血压，还可以抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，具有抗炎、抗氧化的作用[12-13]。方中多种药物共有的有效成分山柰酚可通过抑制NF-κB介导的炎症反应，对肾脏损害起到保护作用，还可以缓解肾组织病理损伤，抑制肾组织细胞凋亡，改善肾功能[14-15]。杜忠祥等[16]研究发现，黄芩素可以降低血清尿素氮（BUN）水平、提高肾脏组织超氧化物歧化酶（SOD）活性并降低丙二醛（MDA）含量，减轻肾脏组织细胞凋亡，对肾损伤有修复作用。

根据PPI网络的分析，本研究结果显示，雌激素受体1（ESR1）、蛋白激酶B1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等基因的度值较高，且属于核心基因，因此，推测这些基因可能在壮肾固精方的起效过程中发挥明显的靶向作用。有研究表明，ESR1可抑制TGF-β1/Smad信号通路，从而改善肾小管间质纤维化，保护肾功能[17]。Gong等[18]研究发现，过表达ESR1编码的雌激素相关受体α（ERRα）可以促进大鼠肾小球系膜细胞的凋亡和炎症反应。有研究证明，Akt的活化可使多聚体IgA（pIgA）与单核细胞上的FcαRI受体结合，形成循环pIgA-FcαRI复合物[19-20]，并沉积在肾小球系膜区，引发系膜细胞的炎症反应，这一过程在IgA肾病发展中可能起关键作用[21]。MAPK参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症反应等多个环节，起重要的调节、控制作用，已有研究证实其与IgA患者肾小管间质纤维化有关[22]，可以影响IgA患者的预后。

最后，本研究对壮肾固精方治疗IgA肾病的重要靶点进行GO和KEGG富集分析。根据GO、KEGG分析结果，发现壮肾固精方起效的生物学过程主要与炎症反应和氧化应激的反应有关：核因子E2相关因子2（Nrf2）是一种可以保护机体免受氧化应激和调节炎症反应的关键转录因子，与机体炎症反应和氧化应激反应有重要关系，而越来越多证据显示，其在各类慢性肾脏病中发挥主要作用[23-25]。这表明氧化应激在IgA肾病的发展过程中具有重要作用。本研究所筛选出的有效成分及重要靶点的主要作用也显示，壮肾固精方治疗IgA肾病的作用机制主要与炎症反应和氧化应激反应有关，这与GO、KEGG分析结果相符。可据此推测，壮肾固精方主要通过调控细胞炎症反应和氧化应激过程发挥治疗IgA肾病的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学分析壮肾固精方治疗IgA肾病的有效成分、作用靶点和起效机制，进一步阐释了壮肾固精方的治疗作用机制，为临床选择治疗方案和后续基础研究指明了方向和奠定了理论基础。但由于壮肾固精方组成药物较多，并且受限于当前数据库，其发挥治疗作用的具体机制尚需要更进一步的研究。