超高效合相色谱(UPC2)技术快速测定植物油中的维生素A和维生素E

彭嬿雯，王 波，刘阿静，王莹捷，把灵珍，韩舜愈，管贤贤，周小平

(1.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，兰州730070； 2.兰州海关技术中心，兰州730000；3.西北师范大学 地理与环境科学学院，兰州730070)

维生素A与维生素E是人体正常代谢和功能所必需的脂溶性维生素，其中：维生素A(视黄醇)的主要功能是参与视觉细胞视紫红质的合成[1]，维持人类视觉与骨骼的健康，促进细胞的分裂识别以及维护免疫系统的完整性；维生素E具有防癌、抗氧化、抗衰老等功效[2-4]，根据结构不同其分为α-、β-、γ-、δ-生育酚(Tocopherol, T)和生育三烯酚(Tocotrienol, T3)[5]，其中α-生育酚的生物活性最强，其次为β-、γ-生育酚，δ-生育酚的生物活性最弱，抗氧化能力强弱则是α-生育酚<β-生育酚<γ-生育酚<δ-生育酚[6-7]。植物油中含有丰富的天然维生素E，是人体从外界食物中获取维生素E的主要来源，研究建立同时快速检测植物油中维生素A和维生素E的方法，除了对鉴定植物油的营养价值和品质具有重要意义外，同时能更好地评估人体从膳食摄入这两种营养素的状况。

目前，测定脂溶性维生素A和维生素E的方法主要有分光光度法[8]、电化学法[9-10]、气相色谱法[11]、高效液相色谱法[12]、液质联用法[13]等。其中高效液相色谱法(HPLC)应用最广泛，如：姜波等[14]建立了HPLC同时测定植物油中维生素A和不同构型维生素E含量的方法，但β-维生素E和γ-维生素E的保留时间一致，不能分离；乔坤云[15]、王晖[16]、陈春晓[17]等采用反相HPLC对不同食品中维生素A和维生素E含量进行测定，但检测时间较长，样品前处理需要经过皂化处理，无法实现快速分离检测的目的。刘莹等[18]建立了固相萃取-在线二维快速同时测定食品中维生素A、D和4种维生素E异构体的含量，实现了4种维生素E异构体的有效分离，样品前处理方法使用固相萃取代替液液萃取，简化了前处理操作步骤，提高了检测效率。反相HPLC无法分离β-维生素E和γ-维生素E，样品需经过皂化，操作烦琐，而正相HPLC虽然可实现维生素E各种异构体的分离[19]，但流动相挥发性强，溶剂强致癌，对仪器损耗较大。因此，建立快速高效的维生素A和维生素E检测方法具有重要意义。

超高效合相色谱(UPC2)作为一种新型色谱分离技术，可分析不适用气相色谱(GC)分析的高沸点样品，又比传统的HPLC分析速度快，且具有有机溶剂使用量少、重现性好、绿色环保的优点[20-22]。因此，本实验运用UPC2技术，对不同植物油样品中的脂溶性维生素A和维生素E(大量文献表明，植物油中δ-生育酚含量较少，对总维生素E含量贡献不大，故本文只对α-、β-、γ-生育酚进行研究)进行测定，以期建立一种快速高效的分离检测方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

26份植物油样品，主要来自实验室储存以及当地超市。

维生素A标准品(纯度≥99.3%)、α-生育酚标准品(纯度≥98.4%)、β-生育酚标准品(纯度≥96%)、γ-生育酚标准品(纯度≥96%)，上海安谱实验科技股份有限公司；异丙醇、甲酸、乙腈、甲醇，均为色谱纯，德国Merck公司；无水乙醇、正己烷，均为分析纯，上海国药集团；屈臣氏饮用水，广州屈臣氏食品饮料有限公司；CO2(纯度>99.997%)，兰州汇能公司。

Acquity UPC2仪，美国Waters公司；电子天平(±0.01 g)；分析天平(±0.000 1 g)，德国Sartorius公司；3K30冷冻离心机，美国Sigma公司；MS3涡旋仪，德国IKAMS3公司；移液枪(100～1 000 μL、20～100 μL)，美国Thermo Electron公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别精确称取各标准品0.010 0 g(精确至0.000 1 g)，用异丙醇准确定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的标准储备液，于-18℃避光储存，使用期限不超过3个月。

分别取一定体积的维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚标准储备液，用流动相(助溶剂)配制成维生素A质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L，α-生育酚、γ-生育酚质量浓度均为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L，β-生育酚质量浓度为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 mg/L的系列标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

准确称取3.00 g植物油样品(精确至0.01 g)于50 mL聚乙烯塑料离心管中，加入提取溶剂异丙醇定容至10 mL。涡旋振荡5 min，充分混匀后取1.5 mL上清液，经0.22 μm有机相滤膜过滤后装入棕色进样小瓶中，直接进行UPC2测定(整个过程中避光)。

1.2.3 UPC2色谱条件

HSS C18SB色谱柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相A为CO2，流动相B(助溶剂)为0.2%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱程序见表1；检测波长290 nm；动态背压13.1 MPa；柱温50℃；进样量1.0 μL。数据处理使用Empower 3软件。在对色谱条件进行优化实验时，只改变其中一个变量的值，其他条件不变。

表1 流动相梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

为了使4种脂溶性维生素(维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚)能够在较短的时间内实现良好的分离，本实验比较了2种填料的UPC2色谱柱HSS C18SB(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)和CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)对目标物分离的影响。HSS C18SB色谱柱填装了高强度硅胶颗粒，有利于脂溶性维生素、碱性类物质的分离，CSH Fluoro-Phenyl色谱柱固定相表面带电杂化颗粒，适用于天然产物的分离[23]。实验结果表明，CSH Fluoro-Phenyl色谱柱无法有效分离4种脂溶性维生素，其色谱峰均互相包埋或形成肩峰，而HSS C18SB色谱柱在5 min之内可实现4种脂溶性维生素的有效分离(见图1)。因此，本实验选用HSS C18SB作为分析色谱柱。

图1 HSS C18 SB色谱柱分离4种脂溶性维生素的色谱图

2.1.2 助溶剂的选择

本实验考察了4种不同极性的助溶剂甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇对4种脂溶性维生素分离效果的影响。结果表明，随着助溶剂极性的降低，流动相的洗脱能力和选择性也发生了相应的变化，使用乙腈、乙醇作为助溶剂时，无法将4种脂溶性维生素很好地洗脱出来甚至不出峰，使用异丙醇作为助溶剂时，基线发生严重的漂移，使用甲醇作为助溶剂时，4种维生素可达到分离的目的。为了增强维生素在色谱柱上的保留效果，改善峰形，在助溶剂甲醇中加入甲酸以改变流动相的酸性环境，实验比较了3种不同体积分数(0.05%、0.1%、0.2%)的甲酸甲醇溶液对4种脂溶性维生素峰形的影响。结果表明，0.05%甲酸甲醇溶液和0.1%甲酸甲醇溶液基本未改变4种脂溶性维生素的峰形，而0.2%甲酸甲醇溶液对4种脂溶性维生素的峰形均有较好的改善。因此，选用0.2%甲酸甲醇溶液作为助溶剂。

2.1.3 色谱柱温度的选择

色谱柱的温度(柱温)对目标物的分离度和保留时间均有一定的影响，当柱温升高、背压减小时,超临界CO2密度变小，化合物的保留时间延长。本实验考察了柱温在30、35、40、45、50、55℃时对4种脂溶性维生素分离的影响。结果表明：柱温低于40℃时，只能分离出3种脂溶性维生素；柱温为45℃时，α-生育酚和β-生育酚分离不完全，出现拖尾；柱温为50℃时，4种脂溶性维生素完全分离，且峰形良好。考虑到柱子的使用情况以及实际样品的分离度、系统压力等因素，最终选择色谱柱温度为50℃。

2.1.4 流速的选择

流速也是影响目标物峰形和保留时间的重要因素之一。随着流速的增大，目标物的出峰时间提前，峰形变得尖锐，但是流速过大容易造成柱压过高，影响峰形，缩短色谱柱的使用寿命；较小的流速会造成分析时间过长，峰展宽较大，影响灵敏度。本实验在0.8～1.5 mL/min范围内对流速进行了优化。结果表明，当流速为0.8 mL/min时，分离时间延长,无法达到快速分离的目的，当流速为1.2 mL/min时，α-生育酚和β-生育酚分离不完全。因此，选择1.0 mL/min为最佳流速。

2.2 样品前处理提取溶剂的选择

按1.2.2方法，分别用正己烷、异丙醇、甲醇作为提取溶剂，通过比较4种脂溶性维生素的峰面积评价3种溶剂对植物油中目标物的提取效果，结果如图2所示。

图2 不同提取溶剂对4种脂溶性维生素的提取效果

由图2可见，甲醇对植物油中维生素A和维生素E的提取率最低，其次是正己烷，而异丙醇的提取率最高。计算结果表明，正己烷、异丙醇、甲醇作为提取溶剂时，维生素A峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为2.61%、3.08%、2.35%，α-生育酚峰面积的RSD分别为2.42%、1.93%、2.79%，β-生育酚峰面积的RSD分别为3.11%、2.28%、3.50%，γ-生育酚峰面积的RSD分别为3.52%、3.02%、3.34%。异丙醇提取4种脂溶性维生素时峰面积的RSD相对较好，因此选择异丙醇作为样品中4种脂溶性维生素的提取溶剂。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、方法检出限和定量限

将维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚系列标准工作溶液进行UPC2测定，以标准溶液的质量浓度(X)为横坐标，对应峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。同时，以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，结果如表2所示。

表2 维生素A和维生素E的线性方程、相关系数、检出限和定量限

由表2可见，标准曲线回归方程的相关系数(R2)均在0.999 5及以上，说明4种脂溶性维生素在相应的线性范围内呈现良好的线性关系，方法的检出限和定量限分别为0.1～1.5 mg/L和1.0～5.0 mg/L。

2.3.2 加标回收率

准确称取空白样品3.00 g(精确至0.01 g)于离心管中，分别添加低、中、高3个水平的标准工作溶液，按照1.2.2的方法进行前处理，按1.2.3条件进行测定，每个加标水平平行测定6次，计算平均回收率及RSD，结果如表3所示。

表3 样品加标回收率及相对标准偏差(n=6)

由表3可见，3个不同加标水平的回收率在82.00%～106.82%之间，RSD在0.94%～3.57%之间，说明该方法的准确度良好。

2.3.3 精密度

取质量浓度为50.0 mg/L的4种脂溶性维生素标准工作液于一天内连续进样测定6次，记录4种脂溶性维生素的峰面积并计算峰面积的RSD。结果表明，维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面积的RSD分别为2.08%、1.94%、3.51%和2.72%。同样取质量浓度为50.0 mg/L的4种脂溶性维生素标准工作液，每天进样测定3次，连续进样测定3 d，记录4种脂溶性维生素的峰面积并计算峰面积的RSD。结果表明，维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面积的RSD分别为3.97%、5.13%、3.74%和4.66%，说明本方法的精密度良好。

2.3.4 重复性

精密称取3.00 g植物油样品6份，按照1.2.2的方法进行样品前处理，按1.2.3条件进行测定，记录4种脂溶性维生素对应的峰面积并计算峰面积的RSD。结果表明，维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面积的RSD分别为2.25%、3.80%、3.31%和3.69%，说明本方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性

取同一供试样品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h按1.2.3条件进行测定，计算峰面积的RSD。结果表明，维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚峰面积的RSD分别为3.12%、2.82%、4.04%和2.97%，表明该方法的样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 实际样品的测定

采用优化的样品前处理方法及色谱条件对26份植物油样品中的维生素A和维生素E含量进行测定，每个植物油样品平行测定3次，结果见表4。

表4 26份植物油样品中维生素A和维生素E含量的测定结果 mg/kg

由表4可知：在所检测的26份油样中，大豆油、橄榄油、花生油、菜籽油、葵花籽油含有α-生育酚和γ-生育酚，不含β-生育酚和维生素A，其中葵花籽油中α-生育酚含量最高，为561.57 mg/kg，大豆油中γ-生育酚含量最高，为532.17 mg/kg，橄榄油中主要以α-生育酚为主，而菜籽油中主要以γ-生育酚为主；玉米油、火麻油、芥末调味油中不含维生素A，但含有α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚3种组分，且主要以γ-生育酚为主，平均含量约700 mg/kg，是所测样品中γ-生育酚含量最高的3种植物油；鲜花椒调味油、沙棘籽油、小磨香油、稻米油和食用植物调和油中检出含量极低的维生素A，平均值不超过10 mg/kg，除小磨香油外，其余4种植物油中均含有α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚；芝麻油、压榨亚麻籽油和胡麻油中只检出γ-生育酚。不同植物油样品中维生素A和维生素E含量总体分布与吴轲等[24]报道的结果基本一致。

3 结 论

本文利用超高效合相色谱法同时测定植物油中维生素A、α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚，在5 min内可实现维生素A和不同构型维生素E的分离，且β-生育酚和γ-生育酚分离效果良好。该方法检测时间短、灵敏度高、稳定性良好、前处理操作简便快速，可作为植物油中不同脂溶性维生素同时检测的新方法，提高检测效率。采用已建立的方法对不同植物油样品中的维生素A和维生素E进行测定，结果表明，植物油中维生素E的含量最高，其中以α-生育酚和γ-生育酚为主，β-生育酚含量相对较低，而维生素A只在个别植物油样品中检出，且含量很低。