气相色谱外标法测定蛋黄卵磷脂(供注射用)中7种脂肪酸含量

温恺嘉，梁北梅，李咏华，林元亨，唐顺之，许文东

(广州白云山汉方现代药业有限公司 中药提取分离过程现代化国家工程研究中心, 广东省药用脂质重点实验室，广州510240)

蛋黄卵磷脂是从蛋黄中提取并精制得到的天然磷脂混合物，主要成分为磷脂酰胆碱[1-3]，具有较好的乳化、分散、消泡等特性，被广泛用于脂肪乳、脂质体等特殊注射剂种[4-6]。当作为各类肠外营养剂、载药脂肪乳辅料或产品中的蛋黄卵磷脂用量达10%或以上时，需考察蛋黄卵磷脂脂肪酸含量。

目前，国内暂无权威资料收录蛋黄卵磷脂脂肪酸测定方法，而脂质类脂肪酸测定方法在《中国药典》四部与GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》均有收录。但国标方法前处理复杂，气相运行时间需90 min，测定效率低。《中国药典》四部涉及脂质脂肪酸测定方法在大豆油、橄榄油、山嵛酸甘油酯、月桂酰聚氧乙烯甘油酯、油酸山梨坦、氢化大豆油、氢化蓖麻油等品种中均有收录，其中大豆油脂肪酸测定方法与橄榄油、山嵛酸甘油酯、氢化蓖麻油脂肪酸测定方法完全一致，说明该法适用范围广，因此本文选择中国药典四部《大豆油》脂肪酸项(下称“大豆油中典方法”)为参考，通过适度优化，建立一种适用于蛋黄卵磷脂(供注射用)脂肪酸含量测定方法，该方法经过方法学验证，可应用到企业内控及小试研究中，为日后的分析工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蛋黄卵磷脂(供注射用)样品(批号I30181201、I30181202、I30181203)，广州白云山汉方现代药业有限公司。

棕榈酸甲酯(BCBV7285，99.0%)、硬脂酸甲酯(GCBV9730，99.5%)、油酸甲酯(BCBR9854V，99.0%)、亚油酸甲酯(BCBV3078，98.5%)、花生四烯酸甲酯(SLBV7453，100.0%)标准品，Sigma公司；棕榈油酸甲酯(92720046，99.0%)、二十二碳六烯酸甲酯(Z9920150，99.0%)标准品，ANPEL公司；正庚烷、甲醇、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠，均为分析纯，广州化学试剂厂；14%三氟化硼甲醇溶液，分析纯，美国Sigma公司。

安捷伦7890A气相色谱仪(搭配FID检测器)，赛默飞变色龙色谱工作站，岛津AP225WD电子天平，明澈-D 24UV纯水/超纯水系统，SGH-500型恒温水浴锅，HWS-26氢气发生器，高纯氮气(纯度≥99.999%)，干燥空气。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

Agilent DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氮气(纯度≥99.999%)，恒流流速1.0 mL/min；柱升温程序为初始温度210℃，保持10 min，以8℃/min速率升至250℃，保持35 min，共运行50 min；进样口温度260℃；检测器温度270℃；进样量1 μL；分流进样，分流比50∶1;空气流速300 mL/min；氢气流速30 mL/min。

1.2.2 标准曲线的制作

1.2.2.1 单一标准品储备液的配制

分别精密称取棕榈酸甲酯标准品200 mg、棕榈油酸甲酯标准品10 mg、硬脂酸甲酯标准品100 mg、油酸甲酯标准品200 mg、亚油酸甲酯标准品100 mg、花生四烯酸甲酯标准品100 mg、二十二碳六烯酸甲酯标准品10 mg，以正庚烷溶解并定容至10 mL，得7种单一标准品储备液。

1.2.2.2 系列混合标准工作液的配制

取1.2.2.1单一标准品储备液，按表1以正庚烷依次稀释成6个级别含7种标准品的系列混合标准工作液。

表1 6个级别系列混合标准工作液质量浓度

1.2.2.3 标准曲线的绘制

取一定量表1中的系列混合标准工作液，按照1.2.1的色谱条件进行气相色谱分析，每个级别混合标准工作液连续进样3次，以各组分质量浓度(x)为横坐标，各组分峰面积均值(y)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 样品的前处理

称取蛋黄卵磷脂(供注射用)样品0.1 g，置于20 mL具塞试管中，加0.5 mol/L氢氧化钠甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加热30 min，加入14%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加热30 min，取出放冷，精密加入正庚烷4.0 mL，密塞振摇2 min后，将液体转移至分液漏斗中，加饱和氯化钠溶液10 mL，摇匀，静置使分层，取上层液，纯水洗涤3次，每次2 mL，经无水硫酸钠干燥后作为样品溶液，待测。

1.2.4 脂肪酸含量的测定

取空白溶剂(正庚烷)、系列混合标准工作液、样品溶液，按1.2.1色谱条件一次进样，记录色谱图，根据保留时间定性，由标准曲线求得试样中7种脂肪酸的质量浓度，外标法定量，7种脂肪酸含量按下式计算。

(1)

式中：X为样品中各脂肪酸的含量；ρ为样品溶液中各脂肪酸甲酯的质量浓度，mg/mL；V为样品溶液加入正庚烷的体积，mL；m为样品质量，g；f为系数，7种脂肪酸对应的系数值参照GB 5009.168—2016。

2 结果与分析

2.1 样品定量方法的选择

依据GB 5009.168—2016，脂肪酸含量测定的定量方法有3种，分别为峰面积归一化法、外标法、内标法。峰面积归一化法多用于高纯度的植物油类(如大豆油、橄榄油等)定量，适用于相对定量[7-9]；其他成分较复杂的物质，样品中含有一定量的未甲酯化成分，应进行绝对定量，外标法、内标法精准[10-11]，更适合采用。取批号I30181201的样品，按1.2.3方法制备样品溶液，分别按3种定量方法在1.2.1色谱条件下测定(内标物选择山嵛酸甲酯)脂肪酸含量，结果见表2。由表2可看出，3种定量方法所得测定值各不相同。考虑到需体现样品中其他杂质的含量，需进行绝对定量，因此选择外标法与内标法定量更合适，按上述条件对外标法和内标法的脂肪酸回收率进行测定，对比两种定量方法的准确度，结果见表3。由表3可看出，外标法的回收率更合理，因此选择外标法作为定量方法。

表2 3种定量方法得到的脂肪酸含量对比 %

表3 2种定量方法的回收率对比 %

2.2 前处理方法考察

2.2.1 甲酯化加热方式考察

根据大豆油中典方法，甲酯化加热采用锥形瓶及回流管进行，容器内表面积较大。实验发现，样品甲酯化样液只有8 mL，容器内表面积大易造成目标成分附着瓶壁，不利于样液转移。因此，本实验采取具塞试管直接水浴加热法，减少样液接触的容器内表面积从而减少误差引入。

2.2.2 提取方式考察

根据大豆油中典方法，甲酯化完成后，精密加入提取溶剂在65℃加热提取一定时间，取出冷却至室温后再振荡提取一定时间。本方法去除加热步骤，在加入正庚烷后室温振摇提取，通过对两种提取方式分别进行准确度验证发现，二者回收率相当。因此，本实验选择加入正庚烷室温下振摇提取，既简化实验过程，又节省了时间。

2.3 起始柱温考察

取1.2.2.2中的第3级别混合标准工作液分别在起始温度为210℃与230℃，其他条件不变的情况下进样，记录色谱图，不同起始柱温色谱图对比结果见图1。

由图1可知，色谱条件的起始柱温采用210℃，该温度能使各组分峰达到基线分离。若以大豆油中典方法的230℃为起始柱温，则无法完全实现基线分离。

注：1.棕榈酸甲酯；2.棕榈油酸甲酯；3.硬脂酸甲酯；4.油酸甲酯；5.亚油酸甲酯；6.花生四烯酸甲酯；7.二十二碳六烯酸甲酯。下同

2.4 样品专属性考察

按照1.2.3的方法，分别取纯水0.1 g以及批号I30181201的样品与1.2.2.2中的第3级别混合标准工作液，制备空白溶液、样品溶液、对照溶液，并将样品溶液与混合标准工作液按1∶1混合，制备样品加标溶液。精密吸取上述溶液1 μL，按照1.2.1色谱条件进样检测，进行样品专属性考察，结果如图2所示。

由图2可看出，本方法的样品的专属性符合规定。

注：A.空白溶液；B.对照溶液；C.样品溶液；D.样品加标溶液。

2.5 线性关系考察

按照1.2.2方法绘制标准曲线，得到7种脂肪酸甲酯的标准曲线方程、相关系数(R2)及线性范围，结果见表4。由表4可看出，在相应质量浓度范围内，7种脂肪酸甲酯质量浓度与对应的峰面积的线性关系良好，相关系数(R2)大于0.999。

表4 线性关系考察结果

2.6 精密度实验

取批号I30181201的样品，按1.2.3方法处理，按1.2.1色谱条件进行分析，进行重复性与中间精密度实验，其均值与相对标准偏差(RSD)见表5。由表5可知，本方法精密度良好。

表5 精密度实验结果(n=6)

2.7 准确度验证

取批号I30181201的样品，按照本文建立的方法对7种脂肪酸进行加标回收率实验，回收率均值见表3，7种脂肪酸回收率RSD依次为棕榈酸1.9%、棕榈油酸1.8%、硬脂酸0.6%、油酸1.2%、亚油酸0.6%、花生四烯酸0.7%、二十二碳六烯酸1.1%，符合准确度要求。

2.8 溶液稳定性实验

取批号I30181201的样品，按1.2.3方法制备样品溶液1份，分别在0、2、4、6、8、12、18、24、36 h内，将溶液在1.2.1色谱条件下反复进样，7种脂肪酸峰面积RSD均小于3%，说明溶液稳定性在36 h内保持良好。

2.9 系统耐用性考察

通过改变不同的氮气流速、不同的进样口/检测器温度、同一型号不同批号的色谱柱共4个单因素条件，分别进行7种脂肪酸含量测定，比较4个因素及原始条件下7种脂肪酸含量的测定结果。结果发现，4个单因素条件下得到的7种脂肪酸含量的RSD均小于3%，表明条件微小变动对各组分含量测定结果影响不大。

2.10 样品测定

取蛋黄卵磷脂(供注射用)样品3批，按1.2.3方法进行处理，在1.2.1色谱条件下测定其中的7种脂肪酸含量，每批样品平行制备3份样品，结果见表6。由表6可知，蛋黄卵磷脂(供注射用)中棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸含量较高。计算每批次7种脂肪酸的RSD，结果发现，每批次7种脂肪酸的RSD均小于等于2%，数据符合精密度要求，表明该方法可用于蛋黄卵磷脂(供注射用)7种脂肪酸含量的测定。

表6 3批蛋黄卵磷脂(供注射用)脂肪酸含量测定结果(n=3) %

3 结 论

本研究以大豆油中典方法为参考依据，分别对定量方法、前处理方法、色谱条件进行优化与考察，以优化的条件进行线性、精密度、准确度、稳定性、耐用性的考察，证实该方法适用于蛋黄卵磷脂(供注射用)中7种脂肪酸含量的测定。笔者也将本方法进行了拓展，将其应用于蛋黄卵磷脂粗品、脱油蛋黄粉等样品的脂肪酸含量测定中，均能达到较好的精密度与准确度，为日后工艺研究及产品脂肪酸来源考察，提供了可靠的分析与控制手段。