竭香定痛胶囊治疗冠心病网络药理学作用机制研究

曹宝国 刘惠娟 王新舜 王 恒 马 琳 樊红波

1.甘肃省天水市中医医院中医内科，甘肃天水 741000；2.甘肃省天水市中医医院临床药学研究室，甘肃天水 741000；3.甘肃省天水市中医医院心内科，甘肃天水 741000

冠心病即冠状动脉粥样硬化性心脏病，是心脏冠状动脉发生粥样硬化引起官腔狭窄或闭塞而导致心肌缺血缺氧或坏死的心脏病，可严重危害人体健康，近年来，冠心病的发病率随着人们生活水平的提高而逐渐上升[1-2]。竭香定痛胶囊是天水市中医院临床应用多年的中药制剂（甘药制备字Z20190402000），由血竭、檀香、三七、茯苓、细辛、冰片、琥珀及人参等八味药组成，用于治疗证属血脉淤阻气滞血瘀型的冠心病。天水市中医院的多年临床经验表明，竭香定痛胶囊可有效改善冠心病急性发作期的心前区疼痛、胸闷、气短、乏力心悸等症状，并有效降低C 反应蛋白及低密度脂蛋白[3-4]。

网络药理学是现代计算机技术与生物医药发展相融合的一门新兴技术，其通过分析药物、靶点与疾病之间的相互作用，借助节点的连接和关系，阐明中药组分-疾病靶点作用机制[5]。本研究运用网络药理学的方法，分析竭香定痛胶囊治疗冠心病的作用机制，以期为竭香定痛胶囊的进一步临床应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 竭香定痛胶囊有效成分及作用靶点获得

在中药系统药理学数据库（即计算机系统生物学实验室，traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TCMSP，网址：http://tcmspw.com/tcmsp.php）中筛选竭香定痛胶囊药物组方的有效成分，筛选条件如下：所筛选的每味药有效成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，类药性（drug-likeness，DL）＞0.18。复制所有药物组方的全部作用靶点基因（relate targets），应用Perl Critic 软件交互与有效成分相关的靶基因，并剔除无名称基因。

1.2 冠心病靶点的获得及药物-疾病共有基因获得

以“Coronary heart disease”为关键词在OMIM数据库（https://omim.org/search/advanced/geneMap）及GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）中检 索疾病基因靶点并汇总。采用R 语言x64 4.0.1 版本软件对所得药物有效成分靶点与疾病靶点进行映射分析，获得药物-疾病共有基因。

1.3 中药调控及蛋白质相互作用网络构建

应用Perl 软件分析所得药物-疾病共有基因的网络，再采用网络拓扑属性分析软件Cytoscape 对中药调控网络进行可视化分析，构建疾病-有效成分-作用靶点的三元调控网络图。

将药物-疾病共有基因结果导入STRING 数据库（https://string-db.org/）Multiple proteins 中，物种选择“Homo sapiens”，设置“higher confidence 0.700”，隐藏游离节点，以构建蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。

1.4 基因本体功能富集和基因组百科全书通路富集

采用R 语言x64 4.0.1 版本软件bioconductor BiocManager 程序包将药物-疾病交互基因转化为Gene ID，利用bioconductor 中“DOSE”“clusterProfiler”及“pathview”程序包，应用该软件对所得Gene ID 进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集富集和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，设置Pvalue Cutoff 及Qvalue Cutoff均为0.05。

2 结果

2.1 竭香定痛胶囊有效成分及作用靶点基因筛选

在TCMSP 筛选出竭香定痛胶囊共59 个有效成分，4747 个药物相关靶基因，采用Perl Critic 软件筛选剔除无名称基因，共得到36 个有效成分的804 个基因。

2.2 中药-疾病共有基因获得

以“Coronary heart disease”为关键词在OMIM 数据库及GeneCards 数据库中共检索冠心病基因靶点8488 个（去重后7453 个），应用R 语言将其与竭香定痛胶囊有效成分靶点基因进行交集，得竭香定痛胶囊药物组分-冠心病共有基因100 个（图1）。

图1 竭香定痛胶囊治疗冠心病的靶点韦恩图

2.3 中药调控及PPI 网络构建

采用Cytoscape 3.6.1 软件构建冠心病-竭香定痛胶囊-作用靶点的的三元调控网络图（图2，封四），结果显示，共有竭香定痛胶囊通过36 种有效成分作用于100 个中药-疾病共同靶点，有效成分为：山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、异牡荆素（isovitexin）、常春藤皂苷（hederagenin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等。

图2 冠心病-竭香定痛胶囊-作用靶点的的三元调控网络图

将所得100 个竭香定痛胶囊与冠心病共有基因导入STRING 中，选择高度相关性（high confid ence 0.700）获得PPI 网络图（图3，封四），结果显示，其中含有100 个共有基因节点及390 条边，PPI 富集后P 值为＜1.0e-16，表明所建立的PPI 网络较预期的互动更为显著。

图3 竭香定痛胶囊与冠心病PPI 网络图

采用R 语言软件分析PPI 网络中排名前30 位的靶点，纵向为基因名称，横向为基因链接节点数目，结果见图4，由图可知丝裂原激活蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）基因链接节点数目最大，为32，其次为表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素-6（intedeukin-6，IL-6）连接点数目均为26，雌激素受体基因1（estrogen receptor gene 1，ESR1）及血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor，VEGFA）基因排名第四，连接点为25，其他基因是胱天蛋白酶3（CASP3）、MYC、细胞周期素D1（cyclin D1，CCND1）及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activate the receptor γ，PPARG）等。

图4 竭香定痛胶囊与冠心病交互作用条形图

2.4 GO 及KEGG 富集分析

在R 语言中安装“DOSE”“clusterProfiler”及“pathview”程序包，将所得drug-disease 转化为Gene ID，并对所得Gene ID 进行GO 及KEGG 富集分析，得GO条目126 条，KEGG 通路116 条（P 值、Q 值均＜0.05），选用前20 条，分别得GO 及KEGG 富集柱状图及气泡图。

GO 富集分析柱状图及气泡图结果见图5（封四），结果显示，竭香定痛胶囊-冠心病共有基因涉及人体功能包括：核受体的活动、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性、DNA 结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、 半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、氧化还原酶活性、泛素样蛋白连接酶结合、单氧酶活动、核激素受体结合、雌激素受体结合、泛素蛋白连接酶结合等功能。

图5 GO 富集图

KEGG 通路富集分析柱状图及气泡图结果见图6（封四），竭香定痛胶囊有效成分作用于冠心病的部分通路基因靶点的结果见图7。结果显示，竭香定痛胶囊有效成分作用靶基因参与疾病调控，涉及PI3K-Akt 信号通路、 液体剪切应力和动脉粥样硬化、乙型肝炎、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、细胞凋亡信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路、甲状腺激素信号通路等。

图7 竭香定痛胶囊治疗冠心病KEGG 富集中的部分信号通路

3 讨论

冠心病属于中医“胸痹”的范畴，胸痹是一本虚标实之证，正虚（心气虚和心阴虚）是其内因，气滞、血瘀、痰浊是冠心病的继发因素[6-7]。竭香定痛胶囊是天水市中医医院从“调脾护心，温阳活血”治疗原则出发，总结出的冠心病治疗经验制剂，由人参、茯苓、血竭、三七、冰片、檀香、细辛及琥珀八味药组成，全方共奏调脾护心、温阳活血、通脉定痛之功。

本文通过网络药理学分析，显示竭香定痛胶囊中共36 个有效成分作用于冠心病基因靶点，其中槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）、异牡荆素（isovitexin），常春藤皂苷（hederagenin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等有效成分基因靶点数目较多。现代药理学研究表明，槲皮素可通过上调细胞内14-3-3 η 蛋白表达水平，稳定线粒体膜电位，抑制mPTP 开放，最终减少细胞凋亡，达到抗心肌缺血再灌注损伤[8-9]，而山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）和异鼠李素（isorha mnetin）可以显著抑制细胞分化终末期的关键转录因子PPARG、重组人CCAAT 增强子结合蛋白（recombinant human CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα）和固醇调节元件结合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）的表达，而影响其下游与脂质合成相关的酶和蛋白的转录水平表达[10-11]。此外，豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等植物甾醇，作为胆固醇类似物可抑制胆固醇肠道吸收，进而降低血液中胆固醇水平、降低心血管疾病风险[12-13]。另外，人参皂苷对缺氧诱导心肌细胞损伤具有一定保护作用[14]。

中药-疾病-基因三元调控网络及PPI 网络结果显示，竭香定痛胶囊通过以上多种成分作用于MAPK8、EGFR、IL-6、ESR1、VEGFA、CASP3、MYC、CCND1 及PPARG 等100 个基因。其中MAPK8 链接点数目最大，MAPK8 是促分裂原活化的蛋白激酶家族中的一员，又称为JNK1/SAPK1 基因，是MAPK 信号转导途径中重要的信号分子，涉及细胞增殖、分化、凋亡等各种机制[16]。研究表明，MAPK8 是TNF-α 促进脂肪细胞凋亡、抑制脂肪细胞分化、促进成熟脂肪细胞去分化、 促进细胞内脂解等作用的上游重要信号分子[17]，MAPK8 可通过诱导线粒体释放细胞色素C 而启动死亡信号途径和细胞凋亡，并可降低分化脂肪细胞抗凋亡特性[17]。而KEGG 富集的信号通路包含细胞凋亡途径、TNF-α 途径，提示竭香定痛胶囊可能通过以上途径上调MAPK8 基因表达，促进脂肪细胞凋亡，进而减少脂肪细胞的分化成熟和聚集。

此外，VEGF 及ESR1 基因与冠心病相关，如VEGFA 基因多态性可增加冠心病风险，已经证实雌激素受体的基因ESR1 和ESR2 降低雌激素对心血管功能的编码，它们分别编码了ERα 和ERβ，其中前者参与血管舒张、心肌细胞凋亡、刺激新血管的形成[18-19]，而在绝经后妇女冠心病的发生中，ERα 参与调节的miR-214 可以抑制VEGF 的表达和生理功能，通过调控VEGF 来影响绝经后妇女冠心病的发病过程[20]。本文GO 和KEGG 富集结果显示，竭香定痛胶囊涉人体类固醇激素受体活性、雌激素受体结合活动及流体剪切应力和动脉粥样硬化等信号通路，从而发挥治疗冠心病的作用，提示竭香定痛胶囊有效成分，可能通过以上基因途径达到治疗冠心病的目的。

综上所述，竭香定痛胶囊治疗冠心病时存在多分子、多基因靶点及多通路协作机制，可能通过槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）等多种成分调控MAPK8、EGFR、IL-6、ESR1、VEGFA 基因蛋白的表达，从而影响人体核受体的活动，配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、氧化还原酶活性、雌激素受体结合、泛素蛋白连接酶结合等功能、氧化还原酶活性（减少氧分子），并调控PI3K-Akt 信号通路、 液体剪切应力和动脉粥样硬化通路、TNF 信号通路及细胞凋亡通路等多种方式治疗冠心病。