甘草查尔酮A对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

万珊珊 孙晓冬 闫 磊

牡丹江医学院组胚教研室，黑龙江牡丹江 157011

脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤，具有发病率高、对放疗和化疗抵抗并容易复发等特点[1-2]。脑胶质瘤是由大脑和脊髓胶质细胞恶变产生的，也是人脑原发性肿瘤中最常见的类型，包括星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤和室管膜瘤。根据世界卫生组织标准，胶质瘤分为4 个等级，包括毛细胞型星形细胞瘤（Ⅰ级）、弥散性星形细胞瘤（Ⅱ级）、间变性星形细胞瘤（Ⅲ级）以及多形性胶质母细胞瘤（Ⅳ级）[3]。中药治疗作为新的治疗方法越来越被关注。甘草查尔酮A 是从甘草根中提取出来的黄酮类化合物，具有多种药理学活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生虫及成骨活性、免疫调节、解痉挛等，目前最受关注的是甘草查尔酮A 的抗肿瘤活性[4]。本实验选取人脑胶质瘤U251 细胞为实验对象，探讨甘草查尔酮A对人脑胶质瘤U251 细胞增殖和凋亡的影响。

1 对象与方法

1.1 细胞系

人脑胶质瘤细胞系U251，购自美国ATCC 公司。

1.2 主要仪器与试剂

5417R 台式高速离心机（德国Ep-pendorf 生命科学公司）；JYH27020 电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；ELX800 酶标仪（美国Bio-Tek 仪器公司）。

甘草查尔酮A，纯度＞98%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司；MTT 试剂购自美国Sigma 公司；胎牛血清购自美国invitrogen 公司。

1.3 实验分组及处理

复苏人脑胶质瘤细胞系U251，将人脑胶质瘤U251细胞分为四组（n=20），对照组予以等量0.9% NaCl 处理，甘草查尔酮A 低剂量组予以15 μmol/L 甘草查尔酮A处理，甘草查尔酮A 中剂量组予以30 μmol/L 甘草查尔酮A 处理，甘草查尔酮A 高剂量组予以45 μmol/L 甘草查尔酮A 处理，干预48 h。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 细胞培养 将人脑胶质瘤U251 细胞培养至含10%胎牛血清、含100 U/L 青链霉素的DMEM 培养基中，置于5% CO2、37℃恒温培养箱中，每隔1～2 d 用胰蛋白酶传代1 次。

1.4.2 细胞增殖实验 将细胞按20 000 个/ml 的密度接种于96 孔培养板上，体积100 μl/孔，每组设3 个复孔。细胞80%融合后，按照分组与给药方法处理细胞，接种48 h 后，取96 孔板行噻唑蓝比色法（methyl thiazolyl tetrazolium colorimetry method，MTT）检测。每孔加MTT 溶液20 μl，37℃避光培育，4 h 弃孔内上清液，加入150 μl DMSO，振荡10 min，充分溶解结晶后用酶标仪测定在490 nm 处细胞的光密度（optical density，OD）值。

1.4.3 检测各组细胞Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表达水平 以实时荧光定量（real-time fluorescence quantification，PCR）法检测各组细胞Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表达水平。根据GeneBank的β-catenin 和Cyclin D1序列，利用Premier 5.0 软件设计可扩增的产物。引物序列：β-catenin 正向引物5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，反向引物5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′；Cyclin D1正向引物5′-GTCACCTAGCAAGCTGCCGAACC-3′，反向引物5′-CGACAGACAAAGCGTCCCTCAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物5′-CAACGAATTTGGCTACAG CA-3′，反向引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。

反应体系：cDNA 模板2 μl，正、反向引物（20 μmol/L）各0.8 μl，dH2O 6.4 μl，SYBR Green 10 μl，总体积20 μl。

反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸10 min，共40 个循环，末次循环72℃延伸7 min。重复实验3 次。

目的基因mRNA 的相对表达量用内参GAPDH基因进行均一化，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相对表达量。

1.4.4 检测各组目的蛋白表达水平 以蛋白印迹法（Western blot）检测各组的增殖细胞核抗原-67（proliferative nuclear antigen Ki-67，Ki-67）、B 淋 巴细胞瘤-2（B lymphoma-2，Bcl-2）表达水平。收集各组后细胞裂解，离心速率为12 000 r/min，离心半径为10 cm，离心10 min。二喹啉甲酸法进行蛋白定量，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离后电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，孵育30 min，通过凝胶成像分析系统，以GAPDH 为内参对照，计算各个样本目的蛋白条带与GAPDH 条带的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS for windows 21.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组人脑胶质瘤U251 细胞培养48 h 后OD 值的比较

MTT 结果显示，甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的OD 值均低于对照组，甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的OD 值均低于甘草查尔酮A 低剂量组，甘草查尔酮A 高剂量组的OD 值低于甘草查尔酮A 中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 四组人脑胶质瘤U251 细胞培养48 h 后OD 值的比较（±s）

表1 四组人脑胶质瘤U251 细胞培养48 h 后OD 值的比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.01；与甘草查尔酮A 低剂量组比较，bP＜0.01；与甘草查尔酮A 中剂量组比较，cP＜0.01

组别 例数 OD对照组甘草查尔酮A 低剂量组甘草查尔酮A 中剂量组甘草查尔酮A 高剂量组20 20 20 20 0.83±0.03 0.67±0.05a 0.42±0.04ab 0.30±0.01abc

2.2 四组人脑胶质瘤U251 细胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达水平的比较

RT-qPCR 结果显示，甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于对照组，甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量均低于甘草查尔酮A 低剂量组，甘草查尔酮A高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于甘草查尔酮A 中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

表2 四组人脑胶质瘤U251 细胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达水平的比较（±s）

表2 四组人脑胶质瘤U251 细胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达水平的比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.01；与甘草查尔酮A 低剂量组比较，bP＜0.01；与甘草查尔酮A 中剂量组比较，cP＜0.01

组别 例数 β-catenin mRNA Cyclin D1 mRNA对照组甘草查尔酮A 低剂量组甘草查尔酮A 中剂量组甘草查尔酮A 高剂量组20 20 20 20 0.56±0.03 0.40±0.06a 0.29±0.04ab 0.21±0.01abc 0.86±0.09 0.65±0.10a 0.46±0.08ab 0.39±0.01abc

2.3 四组细胞Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平比较

Western blot 结果显示，甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于对照组，甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于甘草查尔酮A 低剂量组，甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平低于甘草查尔酮A 中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表3）。

表3 四组细胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表达水平比较（±s）

表3 四组细胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表达水平比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.01；与甘草查尔酮A 低剂量组比较，bP＜0.01；与甘草查尔酮A 中剂量组比较，cP＜0.01

组别 例数 Ki-67 Bcl-2对照组甘草查尔酮A 低剂量组甘草查尔酮A 中剂量组甘草查尔酮A 高剂量组20 20 20 20 0.98±0.02 0.79±0.08a 0.66±0.03ab 0.34±0.01abc 0.64±0.07 0.55±0.02a 0.40±0.03ab 0.29±0.0abc

3 讨论

尽管目前脑胶质瘤治疗技术有了较大进步，患者预后有了较大改善，但脑胶质瘤的治疗仍缺乏突破性进展[5-7]。脑胶质瘤治疗以手术为首选，但由于脑胶质瘤具有浸润生长的特性，与脑组织间无明显边界，难以做到全部切除，必须辅以术后放、化疗杀伤残余肿瘤细胞。胶质瘤的化疗依然存在许多局限性，因此急需革新治疗理念，研发新型药物来有效杀伤胶质瘤细胞，降低复发率及死亡率，提高生活质量以及改善预后等。探索新的治疗药物抑制脑胶质瘤已经成为医学的研究热点，中药治疗将具有非常好的前景。

甘草为我国中医药学中常见的补气类药用植物，其药性平和通行十二经脉，有调和诸药、解毒、补虚、止咳润肺等多种功能，为常用处方药[8]。甘草首载于东汉的《神农本草经》，列为上品，有悠久的药用历史。中医处方离不开甘草，有“十方九草”之说。甘草的主要成分是三萜类化合物和黄酮类化合物[9]。甘草查尔酮A是传统中药甘草的主要成分，其抗肿瘤活性正在成为研究热点[10-12]。

Wnt/β-catenin 信号通路，是一条极其保守的信号转导通路，参与胚胎发育及细胞增殖与分化等正常生理过程，同时，Wnt/β-catenin 通路也是肿瘤进展的关键性通路之一，在很多肿瘤中过渡激活，包括脑、乳腺、结肠、皮肤和肝脏等[13-17]。β-catenin 是Wnt/βcatenin 通路的正性调控因子，生理状态下主要表达在细胞膜上，参与介导同型细胞之间的粘连。Wnt/βcatenin 通路在肿瘤细胞内被激活后促使β-catenin转移，致下游靶基因c-myc、MMP-7 等活化，从而促使肿瘤进展。β-catenin 也是肿瘤干细胞增殖所必需的因素[18]。Wnt/β-catenin 通路的异常激活促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭，而阻断Wnt/β-catenin 信号通路除可以抑制肿瘤的迁移、侵袭和血管生成之外，还可能调节肿瘤的化疗敏感性[19-20]。Cyclin D1是Wnt/βcatenin 信号通路的下游原癌基因，它控制着细胞周期从G1 期向S 期的转变，主要促进细胞增殖。本研究结果显示，甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于对照组，甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量均低于甘草查尔酮A 低剂量组，甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于甘草查尔酮A中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01），这表明了甘草查尔酮A 可能通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制人脑胶质瘤U251 细胞增殖。

增殖细胞核抗原Ki-67 是细胞作为细胞周期中核抗原的决定簇，在细胞周期中所有处于活动期的细胞均可表达，在肿瘤细胞中广泛应用作为处于增殖状态的标志物。Bcl-2 能够抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，属于抗凋亡基因[20]。本研究结果显示，甘草查尔酮A低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于对照组，甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于甘草查尔酮A低剂量组，甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平低于甘草查尔酮A 中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.01），这表明了甘草查尔酮A 可能通过Ki-67 和Bcl-2 蛋白抑制人脑胶质瘤U251 细胞增殖和促进凋亡。

综上所述，甘草查尔酮A 对人脑胶质瘤U251 细胞有抑制增殖和促进凋亡作用，其机制可能与下调β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA、Ki-67 和Bcl-2 表达水平有关。肿瘤增殖是肿瘤患者致死的最直接原因，本实验提示中药治疗脑胶质瘤可能发挥较好作用，这为脑胶质瘤的治疗提供了一个新的方向。