左金丸调控AMPK/mTOR通路介导的自噬途径逆转胃癌耐药机制研究*

刘 艳，孙 健

(上海中医药大学附属曙光医院检验科 201203)

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，早期发病隐匿，缺乏有效诊断指标，大多数患者确诊时往往已是中晚期，并出现远处转移症状，具有高病死率且预后差等特点[1-2]。目前主要采取手术及放、化疗等手段治疗，其中5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是进展期胃癌常用的一线基础化疗药物，但随着用药时间的延长，患者易出现耐药现象，不利于化疗的持久进行[3]。因此，如何逆转胃癌化疗耐药仍是国内外学者研究的热点。自噬是参与细胞生长、分化及死亡，维持细胞内环境稳态的重要调控机制[4]。张玉梅等[5]研究表明，抑制胃癌BGC823细胞自噬能诱导细胞凋亡，增加细胞化疗敏感性。有研究表明，胃黏膜损伤是胃癌癌前病变的主要表现[6]。左金丸是中医经典名方，方中主药黄连和吴茱萸的主要成分小檗碱、吴茱萸次碱等均能保护胃黏膜，对防治胃癌具有一定的作用[7]。既往研究表明，左金丸可抑制胃癌耐药细胞SGC-7901/顺铂(DDP)的增殖，增加化疗敏感性[8]。戚笑笑[9]研究表明，左金丸能显著抑制饥饿状态肺癌A549细胞自噬，抑制细胞增殖。目前，有关左金丸对胃癌耐药影响的相关机制尚未明确，因此，本研究探讨左金丸对胃癌细胞耐药及自噬的影响，以期为有效提高胃癌化疗效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人胃癌细胞株SNU-1(bio-73415)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。5-FU注射液(0.25 g/10 mL)购自山西亚宝药业集团股份有限公司；雷帕霉素(YT1833，25 mg)购自北京伊塔生物科技有限公司；黄连药材(190973)、吴茱萸药材(200508)均购自亳州市誉仁堂药业有限公司；左金丸醇提物制备方法为分别取黄连、吴茱萸药材1 800、300 g，加8倍量75%乙醇，回流提取2次(每次1 h)，合并提取液并回收乙醇，减压干燥，得左金丸醇提物干粉558 g，回收率为26.57%。5-3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，1120-02-1)、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(CA1020)均购自美国Sigma公司；兔抗人B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2，BYFG-70R-36053)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax，ATA25290)、RM-9106微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅰ)抗体(H00008650-A01)、LC3-Ⅱ(FNab04717)、家蚕隔离体蛋白1(sequestosome-1，p62)抗体(H00008650-A01)、AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)抗体(ab51520)、p-AMPK抗体(ATA32549)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR，ATA33361)、p-mTOR(IC194464)、山羊抗兔HRP(F030222)二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。荧光倒置显微镜(型号CKX41-A32FL/PH)购自上海巴玖实业有限公司；流式细胞仪(型号CytoFLEX)购自美国Beckman公司；Tecnai 20 U-Twin型透射电镜购自美国ThermoFisher公司；酶标仪(型号ELx800)购自上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

人SNU-1细胞株培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI -1640培养基、37 ℃饱和湿度、5%二氧化碳及95%氧气培养箱中，进行传代培养，每2～3 天换液，利用5-FU浓度梯度法建立5-FU耐药细胞株，以4.0 μg/mL 5-FU维持细胞耐药性。SNU-1、SNU-1/5-FU细胞均采用5-FU培养，进行后续实验。

1.2.2细胞分组及处理

取对数生长期的SNU-1、SNU-1/5-FU细胞，均在培养基中加入终质量浓度为0、10、20、30、40、50 μg/mL的5-FU溶液，培养48 h。采用MTT法检测细胞耐药性，将细胞接种于24孔板(2.5×105个/孔)进行培养，分别培养48 h后向各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，4 h后弃上清液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡、溶解。在酶标仪490 nm处测定各孔细胞吸光度(A)值，重复3次，取平均值，绘制生长曲线，细胞存活率(%)=(药物处理组A值/药物未处理组A值)×100%。采用线性回归法计算药物半数抑制浓度(median inhibitory concentration，IC50)。采用SNU-1细胞IC50时的5-FU质量浓度(19.05 μg/mL)溶液处理SNU-1(SNU-1组)、SNU-1/5-FU(SNU-1/5-FU组)细胞，处理后的SNU-1/5-FU细胞分为左金丸组(加入含100 μg/mL左金丸溶液[8]培养基继续培养48 h)和左金丸联合自噬激活剂组(加入含100 μg/mL左金丸溶液及250 nmol/L自噬激活剂——雷帕霉素[10]培养基，继续培养48 h)。收集细胞供后续实验。

1.2.3流式细胞术检测SNU-1/5-FU细胞凋亡率

取1.2.2项培养48 h的各组SNU-1、SNU-1/5-FU细胞接种于24孔板(2.5×105个/孔)，参照Annexin-V FITC/PI试剂盒说明书，以5 μL PI、5 μL AnnexinV-FITC双染试剂4 ℃避光染色30 min，稀释；采用流式细胞仪检测SNU-1/5-FU细胞凋亡率。每组设6个复孔，重复3次。

1.2.4透射电镜下观察自噬体

收集1.2.2项培养48 h的各组SNU-1、SNU-1/5-FU细胞分别接种于24孔板(2.5×105个/孔)，胰酶消化(0.25%)，细胞密度达70%～80%时刮取细胞，离心10 min，细胞沉淀采用磷酸盐缓冲溶液清洗，2.5%戊二酸醛固定，4 ℃冰箱保存过夜，50%乙醇常规脱水，环氧树脂包埋，60 ℃聚合48 h，切片(厚度80 nm)，枸橼酸铅染色，置于透射电镜下观察自噬体，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件检测，计算自噬体自噬泡/细胞质总面积。

1.2.5免疫印迹法检测凋亡、自噬相关蛋白及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况

收集1.2.2项培养48 h的各组SNU-1、SNU-1/5-FU细胞以RIPA裂解并提取总蛋白，检测浓度及纯度，采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳法进行电泳，转膜，放入脱脂奶粉(5%)溶液室温封闭2 h，分别加入一抗凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)、自噬相关蛋白(LC-3、p62)、AMPK/mTOR通路相关蛋白(AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR)和内参β-actin，均为1∶500的稀释比，4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，显影、定影，分析各蛋白含量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 SNU-1/5-FU细胞耐药性

随5-FU质量浓度的增加，SNU-1、SNU-1/5-FU细胞增殖率下降，SNU-1的半数抑制浓度(IC50)为19.05 μg/mL，SNU-1/5-FU的IC50为45.07 μg/mL，耐药指数为2.36。见图1、表1。

图1 SNU-1、SNU-1/5-FU细胞在5-FU作用下的细胞存活率

表1 SNU-1、SNU-1/5-FU细胞在5-FU作用下的细胞存活率

2.2 SNU-1/5-FU细胞凋亡情况

SNU-1组、SNU-1/5-FU组、左金丸组、左金丸联合自噬激活剂组细胞凋亡率分别为(31.63±3.59)%、(7.58±1.59)%、(21.16±4.31)%、(15.92±3.45)%。与SNU-1组比较，SNU-1/5-FU组细胞凋亡率明显降低，与SNU-1/5-FU组比较，左金丸组、左金丸联合自噬激活剂组细胞凋亡率均明显升高，与左金丸组比较，左金丸联合自噬激活剂组细胞凋亡率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组细胞凋亡情况比较

2.3 SNU-1/5-FU细胞自噬情况

SNU-1组、SNU-1/5-FU组、左金丸组、左金丸联合自噬激活剂组自噬泡/细胞质总面积分别为(2.83±0.40)%、(8.69±1.30)%、(3.98±0.56)%、(5.03±0.76)%。与SNU-1组比较，SNU-1/5-FU组自噬体数量、自噬泡/细胞质总面积均明显增加；与SNU-1/5-FU组比较，左金丸组、左金丸联合自噬激活剂组自噬体数量、自噬泡/细胞质总面积均明显减少；与左金丸组比较，左金丸联合自噬激活剂组自噬体数量、自噬泡/细胞质总面积均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组细胞自噬情况比较(×200)

2.4 SNU-1/5-FU细胞凋亡及自噬相关蛋白表达

与SNU-1组比较，SNU-1/5-FU组细胞Bax蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高，Bcl-2、p62蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与SNU-1/5-FU组比较，左金丸组、左金丸联合自噬激活剂组细胞Bax蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低，Bcl-2、p62蛋白表达均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与左金丸组比较，左金丸联合自噬激活剂组细胞Bax蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高，Bcl-2、p62蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4、表2。

图4 各组细胞增殖、凋亡及自噬相关蛋白表达比较

表2 各组细胞增殖、凋亡及自噬相关蛋白表达比较

2.5 SNU-1/5-FU细胞AMPK/mTOR通路相关蛋白表达

与SNU-1组比较，SNU-1/5-FU组SNU-1/5-FU细胞p-AMPK/AMPK表达明显升高，p-mTOR/mTOR表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与SNU-1/5-FU组比较，左金丸组、左金丸联合自噬激活剂组p-AMPK/AMPK表达明显降低，p-mTOR/mTOR表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与左金丸组比较，左金丸联合自噬激活剂组p-AMPK/AMPK表达明显升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5、表3。

表3 各组AMPK/mTOR通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

胃癌是胃黏膜上皮细胞恶性肿瘤，发病早期症状不典型，大多数患者于中晚期才得以确诊，以致2年生存率仅为10.00%。目前，化疗是治疗晚期胃癌的优选手段，化疗药物主要通过抑制细胞增殖并诱导凋亡对肿瘤细胞发挥细胞毒作用[11]。胃癌常用一线化疗药物主要以5-FU为主，但由于个体差异及胃癌细胞获得性及内在耐药性，使5-FU治疗胃癌的总生存率仍较低[12]。因此，逆转胃癌细胞对5-FU耐药性具有较大意义。

左金丸源于《丹溪心法》，由黄连、吴茱萸两味中药材组成，具有清肝泻火、降逆止呕等功效，现代药理研究表明，此方能防治胃癌的发生[13]。汤庆丰[14]研究表明，左金丸能促进线粒体转位诱导胃癌DDP耐药株SGC7901/DDP凋亡，增加细胞化疗敏感性。本研究结果显示，SNU-1/5-FU细胞IC50明显高于其亲本株SNU-1细胞，且左金丸联合5-FU对SNU-1/5-FU细胞凋亡具有促进作用，与汤庆丰[14]研究结果一致，说明左金丸可能增加胃癌SNU-1/5-FU细胞对5-FU的化疗敏感性，但相关机制尚有待于深入阐述。

自噬对维持细胞内环境稳态及细胞生存具有重要作用，有研究表明，其有助于肿瘤细胞适应营养物质缺乏、低氧及放化疗刺激等恶劣微环境，增加细胞化疗耐药性[15-17]。自噬激活时LC3-Ⅰ与自噬泡表面磷脂乙酰醇胺结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ含量多少与自噬泡数量呈正比，可以判断细胞自噬活性的强弱；p62是自噬底物并可被LC3-Ⅱ降解，用于评定自噬活性[18-19]。李冬冬等[20]研究表明，抑制NAC-1基因表达可有效抑制卵巢癌DDP耐药株(SKOV3/DDP)的自噬水平，增加细胞对DDP的耐药性。龚永昌等[21]研究表明，姜黄素可通过抑制胃癌AGS细胞自噬诱导细胞凋亡。本研究结果显示，与SNU-1组比较，SNU-1/5-FU组细胞自噬体数量、自噬泡/细胞质总面积、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高，Bcl-2、p62表达均明显降低。说明SNU-1/5-FU细胞对5-FU产生耐药性可能与自噬活性增加有关；而左金丸可明显抑制SNU-1/5-FU细胞自噬，且与左金丸组比较，左金丸联合自噬激活剂组细胞凋亡率明显增加、自噬又一定程度被激活，更加说明左金丸可能通过抑制SNU-1/5-FU细胞自噬诱导细胞凋亡，逆转SNU-1/5-FU细胞化疗敏感性。

AMPK/mTOR通路是一条重要的自噬调节途径，当细胞受到外界刺激时AMPK被激活并发生磷酸化反应，可抑制下游mTOR基因磷酸化反应，进而促进自噬级联反应发生[22]。有研究表明，抑制TRIM14表达可明显抑制胃癌5-FU耐药细胞株SGC7901/5-FU细胞增殖，并诱导细胞凋亡，可能是通过抑制AMPK/mTOR通路活化抑制细胞自噬实现的[23]。本研究结果显示，与SNU-1组比较，SNU-1/5-FU组细胞p-AMPK/AMPK表达明显升高，p-mTOR/mTOR表达明显降低；而左金丸可明显降低AMPK/p-AMPK表达，明显升高p-mTOR/mTOR表达，说明左金丸可能抑制AMPK/mTOR通路活化，增加SNU-1/5-FU细胞化疗敏感性，然而加入自噬激活剂后SNU-1/5-FU细胞AMPK/mTOR通路又一定程度被激活。说明左金丸可能通过抑制AMPK/mTOR通路活化抑制SNU-1/5-FU细胞自噬，进而诱导细胞凋亡，增加细胞化疗敏感性。

综上所述，左金丸可能通过抑制AMPK/mTOR通路介导的自噬，诱导SNU-1/5-FU细胞凋亡，进而逆转细胞耐药性。然而本研究并未对SNU-1/5-FU细胞自噬水平及其与AMPK/mTOR通路的具体作用机制进行探讨，后期应深入阐述。