优化辛酸沉淀工艺参数后结合两步层析法分离纯化IgG效果

罗二华，雷鹏，李雅文，陈婷婷，龚佳莉，匡青芬

1.博雅生物制药集团股份有限公司，江西 抚州344000；

2.江西省血液制品工程研究中心，江西 抚州344000；

3.江西省血液制品重点实验室，江西抚州344000

人免疫球蛋白在临床上主要用于原发性、继发 性以及自身免疫性疾病（如川崎病、血小板缺乏性紫癜等）的治疗，虽然被公认为临床使用最安全的血液制品之一，但随着其使用范围的不断扩大，临床应用安全性也越来越受到关注［1-2］。大量使用静注人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）易引起过敏反应，表现为皮肤潮红、水肿、呼吸急促、血压下降、发热等。发生反应的主要原因是非IgG免疫球蛋白（IgA、IgM）、人血白蛋白、多聚体等杂蛋白的存在，因此有必要最大限度地提高IgG纯度。

自“二战”时美国科学家Cohn等运用适合规模化工业生产的低温乙醇法从人血浆中大量分离出免疫球蛋白制品以来，为了获得安全性、耐受性好的IVIG，国内外研究者针对IVIG的生产工艺进行了大量的研究工作。截至21世纪，研究人员又相继开发了一些新的制备方法，用这些制备方法制备的IVIG又可称为第4代IVIG，新的方法包括辛酸盐-层析法、辛酸盐-PEG-层析法、改良的低温乙醇-层析法［3］。1960年，CHANUTIN等［4］首先报道短链脂肪酸（C6-C12）能与α和β球蛋白形成不溶性复合物使其沉淀，而γ球蛋白不易沉淀，从而可达到分离纯化IgG目的。随后，1969年STEINBUCH等［5］也报道了用辛酸作为沉淀剂纯化IgG时，辛酸浓度、反应pH、离子强度和稀释因子与获得的IgG纯度和得率有关。HABEEB等［6］在1984年用辛酸盐作为沉淀剂沉淀血浆中的非IgG成分，然后用DEAE-纤维素柱层析对含有IgG粗品的上清进行纯化，以血浆为起始原料，IgG的得率可达78%～87%。LEBING等［7］和TREJO等［8］在上述研究的基础上进一步优化了IgG纯化工艺，他们用组分Ⅱ+Ⅲ溶解液代替血浆作为起始原料，通过2次辛酸盐沉淀结合阴离子交换层析分离IVIG，发现辛酸盐在沉淀非IgG成分（组分Ⅲ）时，有灭活病毒的作用，IgG得率可达69%。目前国外已上市产品“Gamimune®N，10%”，即通过辛酸盐沉淀结合阴离子交换层析制备获得［9］。相比于其他制备工艺，第4代IVIG制备工艺具有生产周期短、IgG得率高、制品安全性高的特点。

本研究以组分Ⅱ+Ⅲ沉淀为原料，对辛酸沉淀工艺参数进行优化，并结合后续两步层析法评价10%IVIG中杂蛋白的去除效果。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 组分Ⅱ+Ⅲ沉淀购自博雅生物制药集团股份有限公司；人血白蛋白测定试剂盒（153946B）、IgG测定试剂盒（153067P）购自德国西门子医学诊断产品有限公司；IgA测定试剂盒（321-486）、IgM测定试剂盒（322476）购自美国ZeptoMetrix公司；冰醋酸、氢氧化钠、辛酸钠、醋酸钠购自成都华邑药用辅料制造有限责任公司；AM90L-H搅拌机购自上海昂尼仪器仪表有限公司；QL-866混悬仪购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Evolution201紫外可见分光光度计、Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo公司；BNProSpec全自动蛋白分析仪购自德国西门子股份公司；pH计购自上海仪电科学仪器股份有限公司；AKTApurifier100层析系统、层析柱（XK26／70）、CaptoQ填料、Capto QXP填料购自美国GE公司。

1.2辛酸沉淀工艺参数的优化 为提高组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的综合利用水平，在查阅大量文献的基础上，以组分Ⅱ+Ⅲ为起始原料，并认为影响辛酸沉淀工艺的因素主要为溶解倍数、反应液终pH值、辛酸钠浓度［10-11］。本文采用L9（33）因素水平对溶解倍数（A）、反应液终pH值（B）、辛酸钠浓度（C）3个因素进行优化，设计1个3因素3水平的正交试验方案，见表1。

表1 辛酸沉淀工艺正交设计因素水平表Tab.1 Factors and levels in orthogonal design for caprylic acid precipitation process

取组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，分为9个实验组。每组取100 g沉淀，用相应量的2～8℃注射用水于搅拌机内搅拌溶解，溶解后用2 mol／L醋酸调节pH为4.1左右，控制反应液温度为2～8℃，再搅拌约2 h；滴加0.5 mol／L NaOH调节悬浮pH为4.4左右，加入10%辛酸钠至辛酸钠终浓度达表1要求，再调节反应液终pH至设计要求，搅拌2 h；过滤收集上清，过滤液进行IgG、IgA、IgM、人血白蛋白（albumin，Alb）、纯度检测，计算IgG总量和IgG回收率。

1.3两步层析工艺 取100 g组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，按最佳工艺参数进行辛酸沉淀后，过滤收集上清，进行Q、QXP两步层析纯化。层析前用pH 5.4 0.01 mol／L醋酸钠溶液平衡柱。两步层析纯化均采取流穿模式，即收集流穿液进行IgG、IgA、IgM、Alb、纯度检测，计算IgG总量和IgG回收率，评价杂蛋白去除效果。

1.4IgG、A l b含量的检测 采用散色比浊法［12］。供试品中的蛋白可与特异性抗体形成免疫复合物，这些免疫复合物会使穿过样本的光束发生散射。散射光的强度与样本中相关蛋白的浓度成正比，与已知标准浓度进行对比即可获得结果。1.5Ig A、Ig M含量检测 采用酶联免疫吸附法［13］。供试品中的IgA／IgM与微板上的IgA／IgM抗体结合，被结合的IgA／IgM再与带辣根过氧物酶的IgA／IgM抗体结合，这种酶可与底物四甲基联苯胺发生反应，在450 nm波长下，样品中IgA／IgM的含量与A值成正比。

1.6纯度检测 按照《中国药典》三部（2020版）通则0541第二法，醋酸纤维素薄膜电泳法进行检测。

2 结果

2.1辛酸沉淀工艺最佳参数 不同组别辛酸沉淀工艺参数初纯后，仍有IgA、IgM、Alb杂蛋白的残余，这与辛酸钠非特异性沉淀的特性有关，通过辛酸钠沉淀法初纯无法达到完全纯化IgG的目的。考虑到完全纯化尚需依赖后续两步层析工艺，要求过高的纯度并无意义。因此选择IgG总量和IgG回收率最高的工艺参数，极差顺序为RC＞RB＞RA，即辛酸沉淀工艺对IgG总量的影响顺序为辛酸钠浓度＞反应液终pH＞溶解倍数。见表2。综上，我们认为辛酸沉淀工艺最佳工艺参数为5号实验组：溶解倍数13倍，反应液终pH 5.1，反应液辛酸钠终浓度20 mmol／L。

表2 辛酸沉淀工艺正交试验设计结果Tab.2 Orthogonal design results of caprylic acid precipitation process

2.2两步层析后杂蛋白去除效果 经Q层析主要去除了残余Alb，部分去除IgA和IgM，且IgG未见明显损失；经QXP层析IgA和IgM均已去除至1 mg／L以下。见表3。表明通过辛酸沉淀结合两步层析纯化，可获得高纯度IgG。

表3 两步层析纯化对IgA、IgM、Alb去除效果的影响（x±s，n=9）Tab.3 Effect of two-step chromatography on removal of IgA，IgM and ALB（x±s，n=9）

3 讨论

国内企业提取人免疫球蛋白时，普遍采用低温乙醇法，即通过调节pH、乙醇浓度、温度、离子强度、蛋白浓度等步骤分离纯化。低温乙醇法生产步骤繁琐，得率在50%左右，且最后制品中IgA、IgM等杂蛋白很难除尽。2020年12月1日实施的《中国药典》三部（2020版），将IgA含量新纳入IVIG质量标准中，从法规层面进一步要求提高制品安全性［14］。

本研究涉及的第4代提取工艺中的辛酸沉淀-层析工艺，可最大限度提取血浆组分中IgG，去除残留IgA、IgG、Alb等杂蛋白，在提高吨收得率的同时，确保产品质量安全有效。

组分Ⅱ+Ⅲ沉淀中含有大量γ球蛋白（主要为IgG、IgA、IgM），同时还含有α2和β球蛋白。辛酸是一种天然存在的C8饱和脂肪酸［11，15］，其辛基基团部分有助于其与α和β球蛋白形成不溶性复合物使其沉淀，而γ球蛋白不易沉淀，从而达到分离纯化的目的。本研究结果显示，采用最佳辛酸沉淀工艺，IgG回收率可达78.1%，纯度＞80%。Q层析主要去除了Alb、α球蛋白和β球蛋白等残余蛋白，IgA和IgM也有一定程度降低，IgG回收率＞96%损失较少，纯度有部分提高。QXP层析可去除IgA、IgM至痕量，部分去除IgG多聚体及IgG二聚体，IgG纯度明显提高，但IgG回收率＜85%，有较大提升空间。下一步可通过调整QXP层析工艺条件，进一步提高回收率。

本研究为最大化提取人免疫球蛋白，优选辛酸沉淀工艺所能提取IgG总量最高的工艺参数，优选的参数为溶解倍数的13倍，反应液终pH为5.1，反应液辛酸钠终浓度为20 mmol／L。优选的辛酸沉淀后上清经Q、QXP两步层析纯化后纯度达99.99%，IgA、IgM、Alb含量下降至1 mg／L以下。通过IgG辛酸沉淀工艺参数优选，确定了辛酸沉淀最佳工艺参数，可最大限度提取IgG，提升产品收率，给合两步层析纯化，可获得高纯度IgG，该工艺可用于临床安全的人免疫球蛋白产品开发。

本研究仅涉及IgG提纯步骤，层析获得流穿液后，尚需进行超滤、除菌、病毒灭活等步骤以获得最终制剂。有研究表明，辛酸具有灭活脂包膜病毒的作用［16］。下一步，我们还需进行病毒灭活工艺研究，尤其是小孔径纳滤工艺的优化，以获得安全性高的制剂。