低氧诱导因子1α和长链非编码RNA-SNHG15在脑梗死发生发展中的表达及临床意义

张晨昕，沈越 ，刘瑞雪，张赫楠，赵阳

1.齐齐哈尔医学院附属第三医院神经内科三病房，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院附属第三医院泌尿外科病房，黑龙江齐齐哈尔 161000；3.齐齐哈尔医学院附属第三医院内科，黑龙江齐齐哈尔 161000

脑梗死（cerebral infarction）作为临床上常见的脑血管疾病，具有极高的致死率与致残率，并且严重的影响着人类的健康生活，其发病率也随着社会的发展在不断增长。脑梗死在临床上又称为缺血性脑卒中，主要是由各种原因导致的脑部血液循环发生障碍，使脑部组织局部缺血缺氧甚至坏死，而出现的一种神经功能缺损的临床综合征[1]。长链非编码RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA[2]，参与各种细胞生命活动的调控，与多种疾病的发生发展关系密切[3]。在前期研究中，发现长链非编码RNA—核仁小RNA宿主基因15（SNGH15）在脑梗死患者的外周血中呈异常高表达，并且在低氧胁迫条件下表达明显上调，这提示SNGH15可能与脑梗死的发生有着密切关系。低氧诱导因子-1是一种转录因子，其在机体抗缺血缺氧方面发挥着重要作用[4]，目前研究表明，低氧诱导因子-1与靶基因特定序列结合从而调控它们的转录与表达，并可能参与对低氧反应的信号转导，以维持机体氧的自我平衡与氧的稳态，从而在缺血缺氧脑损伤中发挥重要作用。2021年7—9月本研究通过制备30只大鼠缺血性脑损伤模型，采用qPCR检测上述样本HIF-1α、SNHG15动态表达水平，分析其表达时间关系及表达水平的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

成年SD大鼠30只，体质量250～280 g，雌雄不限，随机分为模型组（24只）：接受动脉结扎和断开手术；假手术组（3只）：只接受动脉分离，并不结扎和断开动脉，直接缝合；正常对照组（3只）：不接受任何手术。模型组再分为缺血2 h、再灌注4 h、再灌注12 h和再灌注24 h组，每组6只。

1.2 方法

1.2.1 制备大鼠缺血性脑损伤模型 模型建立参照Belayev改良Longa法。在室温（25℃）条件下，用3.6%的水合氯醛腹腔麻醉动物，在颈部正中做切口，结扎左侧颈外动脉远端，颈总动脉及颈内动脉置动脉瘤夹，断开左侧颈外动脉后插入末端涂有一层1%的左旋多聚赖氨酸的直径0.25 mm的尼龙线，深度为距颈总动脉分叉处18 mm，2 h后再次麻醉动物并拉出尼龙线。假手术组尼龙线插入深度为15 mm，余步骤相同。手术期间保持大鼠肛温在36.5～37.5℃。假手术组动脉分离后不结扎不断开，直接缝合切口。

1.2.2 取材 分别在2、4、12、24 h采集大鼠外周血，在24 h采集大鼠脑缺血区组织。采用qPCR检测上述样本低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α）、SNHG15动态表达水平，分析其表达时间关系及表达水平的相关性。

1.2.3 荧光定量qPCR检测 按照RNA反转录试剂盒说明合成cDNA。使用实时聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）系统进行实时逆转录PCR（qPCR）。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）作为内参照，用 2－ΔΔCt方法计算各组样本的 SNGH15、HIF-1α的相对表达量，实验重复3次。

1.2.4 TTC染色 将脑组织放入-20℃冰箱速冻20 min，取出后按照实验要求进行切片，切片后将组织放入2%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）中，并用锡箔纸盖住，置于37℃温箱中存放25 min，每5分钟翻动1次切片。然后用10%甲醛溶液固定，留置过夜，观察脑组织切片呈色情况。

1.2.5 EMSA检测 将设置好的探针反应体系加入同位素后，用Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。使用水浴或者PCR仪，73℃反应10 min，加入1 μl探针标记终止液，混匀，终止标记反应，再加入89 μl TE，混匀，存于-20℃冰箱备用。核蛋白样本提取与蛋白定量。生物素标记DNA3’端并去吹TdT。Super-Shift反应，配制6.5%聚丙烯酰胺凝胶，配制好各反应体系，凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）室温结合反应20 min，电泳上样。电转膜，操作方法同常规Western blot转膜操作。紫外交联，将核酸交联于PVDF膜上。化学发光法检测生物素标记的探针。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测 合成SNGH15的3’非编码区，退火后插入荧光素酶基因下游的pCheck2报告荧光素酶载体的Xho1和NotⅠ位点。为了引入突变，将与3’UTR中HIF-1a的结合位点互补的序列(位点 1：5’-UGUUCUAGCUUCUCCC-3’，位点 2：5’-UU CCCCAACCUUCCU-3’，位点3：5’-UUCAUAGCCU UCUCCU-3’)替 换 为 位 点 1：5’-UGUUUCUAG UUACACCC-3’，位 点 2：5’-UUCCU-3’。经核苷酸测序证实构建成功。将SNGH15的阴性对照空载质粒或HIF-1a模拟质粒共转染细胞。荧光素酶检测采用双荧光素酶报告分析系统（PROMEGA）。

1.2.7 染色质免疫共沉淀（Chip） 在细胞生长状态下，加入交联剂，对蛋白-染色质复合物进行交联固定，裂解细胞，释放蛋白-染色质复合物，通过超声或酶解打断长染色质片段，用抗体进行免疫沉淀，富集特异蛋白-DNA复合物，洗脱特异蛋白-DNA复合物，解交联并消化蛋白，进行核酸纯化，纯化后的核酸进行PCR分析。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以（±s）表示，比较采用t检验；两变量之间相关性采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNGH15和HIF-1α的表达情况

与假手术组和正常对照组比较，模型组大鼠外周血与脑组织中SNHG15的表达水平明显升高，且随着时间的推移表达水平在不断升高，12 h达到最高峰，随后迅速下降，24 h时表达仍高于假手术组和正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）；正常对照组与假手术组之间SNGH15的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。与假手术组和正常对照组比较，模型组大鼠 2、4、12、24 h的HIF-1α表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；而假手术组和正常对照组之间HIF-1α表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 SNHG15的表达情况(±s)

表1 SNHG15的表达情况(±s)

组别模型组2 h (n=6)4 h (n=6)12 h (n=6)24 h (n=6)假手术组(n=3)正常对照组(n=3)F值P值表达情况138.33±1.818 152.30±1.417 168.58±1.654 122.03±1.243 53.20±2.331 53.96±1.059 3 729.676＜0.001

表2 HIF-1α的表达情况

2.2 大鼠脑梗死灶的呈色情况

TTC染色检测结果可见，正常对照组和假手术组大鼠脑组织呈砖红色，且未发现梗死灶的存在。模型组大鼠脑组织呈苍白色，并且与周围正常组织之间边界清晰，具有明显的梗死区域。见图1。

图1 TTC染色检测大鼠脑梗死灶的呈色情况

2.3 SNHG15调控细胞增殖凋亡的信号通路

荧光素酶报告基因检测：将过表达的HIF-1α质粒和空载质粒分别同SNHG15启动子质粒一起转染细胞，检测报告基因转录活性，发现模型组启动子的活性超过正常对照组的2倍，SNHG15启动子区域具有转录因子HIF-1α的结合位点。见图2。

图2 荧光素酶报告基因检测SNHG15启动子与转录因子HIF-1α结合位点情况

EMSA及染色质免疫共沉淀（Chip）检测：Thermo Scientific Plerce琼脂糖Chip试剂盒显示，NeuroD、C/ebp和RNA聚合酶Ⅱ与近端SNHG15的启动子结合。稳定的过表达克隆细胞因子在0.2%炭葡聚糖处理的培养基中培养3 h，然后用100 ng/mL的HIF-1α处理细胞15 min，使用适当的抗体和Pierce Chip Kit对3个靶点进行染色质免疫沉淀，发现HIF-1α处理后与SHNG15的启动子结合增加。见图3。

图3 EMSA及染色质免疫共沉淀（Chip）检测SNHG15启动子与转录因子HIF-1α结合情况

3 讨论

小核仁RNA宿主基因15（SNHG15）是一种产生短半寿命lncRNA的snoRNA宿主基因[5]，在肿瘤细胞中上调并参与多种癌症的发生发展，涉及到肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学过程[6]，在细胞的增殖凋亡调控中发挥着重要的作用。

本研究中，在低氧条件下SNHG15的含量升高，并且与缺氧的程度有着密切关系，与正常对照组比较，模型组大鼠外周血中SNHG15的表达水平在2、4、12、24 h分别为（138.33±1.818）、（152.30±1.417）、（168.58±1.654）、（122.03±1.243），4个时间点上都显著增高，其表达从2 h开始发生，随着时间的推移不断升高，12 h达到峰值，随后迅速下降，24 h时SNHG15的表达水平仍然高于正常对照组大鼠（P＜0.05）；而假手术组大鼠（53.20±2.331）与对照组大鼠（53.96±1.059）之间SNHG15的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而模型组大鼠SNHG15的表达水平在上述十个时间点也均高于假手术组大鼠（P＜0.05）。这与冀方超等[7]的研究结果一致，其研究中，SNHG15在急性脑梗死患者的外周血中异常高表达，表达量为（5.94±1.05），尤其是重症患者最高，SNHG15异常表达的表达量（6.76±0.61）与NIHSS评分呈正相关（r=0.730，P＜0.05），与神经功能缺损程度以及多项病理参数有着密切的关系。同时，相关研究显示，低氧培养时可促进SNHG15表达（5.877 5±0.365 97）上调（P＜0.05）[8]，这与本文研究结果基本一致，这说明SNHG15的含量与脑细胞缺氧程度之间关系密切。

HIF-1α作为HIF-1的调节亚基，其蛋白转录活性和稳定性都是受到细胞内氧的含量浓度调节[9]，HIF-1α的N端的bHLH域，与下游PAS域共同构成HIF-1α的氧张力感受区[10]，JAK2/STAT3/HIF-1α信号通路的激活或抑制对脑缺血再灌注的影响是复杂的，并不是单一的保护或者损害作用[11]。邓文骞等[12]在对大鼠缺血再灌注脑梗死的实验中发现，大脑局灶性缺血2 h再灌注后，大鼠大脑HIF-1α mRNA的水平和蛋白水平均比对照组高，缺血缺氧激活脑神经细胞HIF-1α基因的表达。本研究中：与正常对照组比较，模型组大鼠2、4、12 h外周血中HIF-1α的表达水平都显著增高（133.10±8.387）、（149.72±1.489）、（168.58±2.363），到 24 h时 HIF-1α的表达水平（84.12±4.574）虽然没有达到显著水平，但是仍然高于正常对照组大鼠（53.97±2.052）（P＜0.05）；而假手术组大鼠与正常对照组大鼠之间HIF-1α的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。这与顾霞等[13]研究结果：发现不同时间点，观察组HIF-1α浓度均显著高于对照组，分别以1、5 d后为例，1 d后大面积梗死组（3 287.6±1 472.1）、小面积梗死组（1 645.7±472.4），5 d后大面积梗死组（1 514.7±329.8），小面积梗死组（920.9±271.4），血清HIF-1a浓度与脑梗死面积存在显著正相关关系（r=0.754，P＜0.05），HIF-1α参与了急性脑梗死的发生、发展过程的研究结果一致。表明在低氧相关疾病及高原病发生过程中，低氧诱导因子1α和相关信号通路中的关键因子的表达水平会发生不同程度变化[14]。表明在缺血缺氧胁迫条件下能够刺激HIF-1α的表达，调控其下游靶基因的表达，而发挥脑保护作用。急性脑梗死患者血清中低氧诱导因子-1α的表达呈动态变化规律，在脑梗死的发生发展中发挥着重要的作用[15]；Notch信号通路在缺血再灌注损伤中被激活，其机制可能与HIF-1α有关[16]，而且高原适应具有遗传学基础，尤其与HIF通路及低氧反应基因密切相关[17]。因此，HIF-1α和SNGH15可作为脑梗死诊断标记分子，能够对脑细胞增殖与凋亡进行调控，并且参与脑梗死的发生发展，LncRNA常常通过竞争性的结合并抑制microRNA而影响其下游基因的表达发挥作用。

综上所述，本研究利用体内动物模型，鉴定SNHG15的启动子区域，发现具有转录因子HIF-1α的结合位点，从而明确HIF-1α和SNHG15在脑梗死中的作用及其机制。有望为临床治疗脑梗死患者提供新的靶点，具有重要的科学意义和应用价值。