抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的制备及特性分析

陈 韵，施 慧，许文军，汪 玮，谢建军

(1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021)

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthyscrocea)养殖中主要细菌性疾病——内脏白点病的病原菌[1]，该菌能感染包括大黄鱼、小黄鱼(Larimichthyspolyactis)、条石鲷(Oplegnathusfasciatus)、黄姑鱼(Nibeaalbiflora)以及石斑鱼亚科鱼类(Epinephelinae)等在内的多种水产养殖经济鱼类。由该病原菌引起的病害造成的损失约占大黄鱼养殖总产值的10%左右，杀香鱼假单胞菌已成为了限制大黄鱼产业规模升级的最重要病原之一。目前大黄鱼内脏白点病的临床诊断主要依赖于病原菌分离培养、16S r RNA序列分析鉴定以及荧光定量PCR检测等分子生物学方法[2-4]，但是病原菌分离培养耗时长，杀香鱼假单胞菌的16S r RNA序列又与其他同属假单胞菌相似度极高[5]，而荧光定量PCR检测等分子生物学方法则对仪器设备要求较高，这使得大黄鱼内脏白点病的临床及时诊断受到极大限制。因此，迫切需要为大黄鱼内脏白点病快速诊断开辟新思路。

单链抗体(scFv)是一种小分子基因工程抗体，其穿透力强、免疫原性低，在疾病防治及医学诊断等领域具有广泛的应用前景。张凡庆[6]制备了针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)及产肠毒素大肠杆菌(ETEC)3种病原的单链抗体(scFv)，攻毒实验证实包载3种scFv的纳米口服制剂可以有效缓解仔猪腹泻症状。PRABIR等[7]从噬菌体抗体库中筛选出针对白斑综合症病毒VP28-4L的scFv，该抗体与其他虾类病毒无交叉反应，具有高特异性，可以在20 min内检出凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)组织匀浆中病毒粒子，极大的缩短了临床诊断时间。因此，利用基因工程技术大量、快速制备能够与杀香鱼假单胞菌特异性结合的scFv，并在此基础上研发一种操作简便、判读简单、适合于现场快速诊断的免疫学方法，有助于实现大黄鱼内脏白点病的临床快速诊断。

ELISA方法具有灵敏、特异、简单、快速及易于自动化操作等特点，适用于临床多样本的检查[8]，制备能与杀香鱼假单胞菌特异性结合的抗体，并利用该抗体研发一种适合于现场诊断的ELISA快速检测方法，可为大黄鱼内脏白点病的快速诊断技术的研发提供科学基础。

本研究以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白为抗原，从兔天然噬菌体 scFv 文库中筛选出特异性单链抗体(Hcp-scFv)，经构建重组质粒pET-30a-Hcp-scFv并进行诱导表达，最终获得6株抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的特异性抗体，为制备抗杀香鱼假单胞菌抗体提供了一种快速、便捷的方法，为进一步研究大黄鱼内脏白点病的快速临床诊断技术奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

杀香鱼假单胞菌Hcp重组复性蛋白由本实验室制备保存；天然兔抗噬菌体抗体库购自武汉普健生物有限公司；感受态大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)pLysS购自北京天恩泽基因科技有限公司；T4连接酶试剂盒、限制性内切酶Hind Ⅲ、Bam HⅠ、Not Ⅰ、Nco Ⅰ购自Thermo Scientific公司；Ni-IDA-Sefinose Colum纯化柱、TMB显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；His-Tag鼠单抗、HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京康为世纪生物科技有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒购自新赛美有限公司。

1.2 单链抗体Hcp-scFv的筛选

1.2.1 抗杀香鱼假单胞菌Hcp单链抗体的筛选

根据T7Select系统手册，取2 mL 蛋白浓度为50 μg·mL-1杀香鱼假单胞菌Hcp重组复性蛋白置于1.5 mL离心管中，4 ℃ 孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with tween-20, PBST)洗涤后加5%脱脂牛奶，30 ℃封闭2 h，PBST洗涤后加入1.2 mL天然兔噬菌体抗体库，37 ℃孵育1.5 h；分别以磷酸盐吐温缓冲液(PBST)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，加入1.2 mL 洗脱液(Gly-HCl 0.1 mol·L-1，pH 2.2)孵育，吸出洗脱液加入中和液(Tris-HCl 1 mol·L-1，pH 8.5)；将洗脱的噬菌体加入经5%脱脂牛奶封闭的试管中，32 ℃孵育1 h，将孵育产物转移至3% 牛血清蛋白(BSA)封闭的试管中，32 ℃孵育1 h，从中取出 10 μL 进行洗脱噬菌体滴度的测定，剩余洗脱液用于扩增噬菌体进行下一轮亲和筛选，滴度测定及噬菌体扩增方法依据参考文献[9]。

1.2.2 Phage-ELISA 鉴定阳性噬菌体克隆

用2 μg·mL-1杀香鱼假单胞菌Hcp重组复性蛋白包被酶标板，4 ℃过夜，PBST 洗涤后加入5%脱脂牛奶封闭，PBST 洗涤3 次，加入扩增的噬菌体100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤加入1∶5 000 稀释的HRP/anti-M13 单抗，100 μL·孔-1，37 ℃孵育 1 h，PBST洗涤后根据TMB显色试剂盒说明书，用酶标仪(Multiskan FC，中国上海)测定其在450 nm 处吸光值，选取Ag-NC>0.5的噬菌体进行序列测定。

表1 每轮的淘选条件

1.3 单链抗体重组质粒的构建

根据筛选出的单链抗体Hcp-scFv序列使用Primer Premier5.0软件设计特异性引物，分别在上下游引物的5′端和3′端引入酶切位点，PCR扩增引物见表2。

表2 Hcp-scFv PCR扩增引物

从筛选出的噬菌体中提取质粒并进行PCR 扩增。PCR扩增反应体系(25 μL)：2.5 μL的10×Reaction buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)，1 μL模板DNA，上下游引物(10 pmol·L-1)各0.25 μL，0.25 μLTaq酶，超纯水补足至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并回收目的条带。将目的条带与表达载体pEASY-T连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，送生工生物工程(上海)有限公司测序，运用DNAMAN 7.0软件对测序获得基因序列进行比对分析。

将测序准确的Hcp-scFv基因序列与表达载体pET-30a(+)进行连接，构建重组质粒，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB/Amp板筛选阳性克隆，37 ℃培养箱18～24 h，挑取单菌落进行菌落PCR 验证，取PCR 结果呈阳性的重组子培养后进行质粒提取和双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒pET-30a-Hcp-scFv送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.4 重组蛋白的小量诱导表达

将测序正确的重组质粒pET-30a-Hcp-ScFv转化至大肠杆菌BL(DE3)pLysS表达感受态细胞，涂布于含有氯霉素(CHL)和卡那霉素(Kn)的Luria-Bertani(LB)平板培养基上筛选阳性克隆，挑取单克隆接种于5 mL LB(含Kn和CHL各5 μL)液体培养基，37℃摇振培养，12～16 h后吸取50 μL菌液转接至5 mL LB(含Kn和CHL各5 μL)液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1摇振培养，当菌液浓度 OD600为0.6～0.8时，添加Isopropyl β-D-Thiogalactoside(IPTG)至终浓度为0.4 mmol·L-1，30 ℃诱导表达，同时设pET-30a(+)空载体转化菌为空白对照。收集菌液离心后取沉淀，加入适量蛋白裂解液(8 mol·L-1Urea，0.1 mol·L-1NaH2PO4，0.01 mol·L-1Tris-Cl，pH=8.0)，30 ℃、180 r·min-1裂解，离心取上清进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。

取经重组蛋白小量诱导表达验证后的重组菌，接种于5 mL LB(含Kn和CHL各 5 μL)液体培养基中，37 ℃ 振荡培养。12～16 h后按 1∶100 转接至 200 mL LB(含Kn和CHL各 200 μL)液体培养基中，37 ℃ 振荡培养并诱导表达。将大量诱导表达的菌液于 4 ℃、7 000 r·min-1离心5 min，PBS缓冲液洗涤沉淀2次，加入10 mL上样缓冲液(0.02 mol·L-1Tris-Hcl，0.25 mol·L-1NaCl，pH=8.0)和10 mg溶菌酶，冰浴上超声破碎30 min，4 ℃、14 000 r·min-1离心，收集上清液(A)。沉淀中加入10 mL蛋白裂解液(8 mol·L-1Urea，0.1 mol·L-1NaH2PO4，0.01 mol·L-1Tris-Cl，pH=8.0)，30 ℃、180 r·min-1裂解，14 000 r·min-1离心，收集上清液(B)。取上清液(A)和上清液(B)进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。

1.5 重组蛋白纯化及Western Blot鉴定

大量诱导表达的菌液于 4 ℃、7 000 r·min-1离心，用PBS缓冲液洗涤沉淀2次，用Ni-Denature-urea缓冲液(8 mol·L-1Urea，0.02 mol·L-1NaH2PO4，0.3 mol·L-1NaCl，pH=8.0)重悬沉淀，30 ℃、180 r·min-1裂解2～3 h，冰浴上超声破碎，4 ℃、14 000 r·min-1离心，取上清。使用0.45 μm滤膜过滤上清液，按照Ni-IDA-Sefinose Colum纯化柱(Ni-IDA-6FF，中国上海)说明书进行重组蛋白纯化。

取纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用半干法转至PVDF膜，加入5 %BSA，4 ℃封闭过夜，次日37 ℃封闭1 h，PBST洗涤3次后加入用PBST稀释的His-Tag小鼠单抗(His-Tag小鼠单抗：PBST=1∶200)，37 ℃反应2 h；PBST洗涤3次后加入用PBST稀释的HRP/山羊抗鼠IgG(HRP/山羊抗鼠IgG∶PBST=1∶1 000)，37 ℃反应1 h，使用ECL化学发光试剂显色2 min，用大量纯净水冲洗PVDF膜终止反应，观察目的条带。

2 结果与分析

2.1 单链抗体Hcp-scFv的筛选

2.1.1 抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体Hcp-scFv的富集淘选

以复性纯化的杀香鱼假单胞菌Hcp重组蛋白为抗原，从天然兔噬菌体抗体库中筛选Hcp的单链抗体，总共经过4轮淘洗筛选富集。比较4轮噬菌体的回收率，第1轮的回收率是1.06×10-7%、第4轮回收率为4.44×10-6%，约是第一轮的42倍(图1，表3)，表明能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了有效的富集。

表3 淘选结果

图1 第4轮筛选出的噬菌体滴度测定图

2.1.2 Phage-ELISA 鉴定阳性噬菌体克隆

从第4轮洗脱物滴度测定的平板上挑取了96个噬菌体阳性单克隆和96个阴性单克隆，通过Phage-ELISA方法，包被复性的Hcp重组蛋白进行噬菌体克隆的特异性检测(表4)。以 Ag-NC>0.5为判断标准，筛选出阳性克隆，对获得的阳性克隆进行扩增并提取噬菌粒，通过Sanger法测序获得scFv基因序列，用DNAMAN软件对获得的序列进行比对分析，删除重复序列，最后共筛选出16个scFv基因(图2)。根据阳性克隆的OD450值，选择OD450值高的scFv，分别命名为A5、F11、D2、D10、G5、G8、H12，进行下一步实验，序列长度及编码的蛋白预测分子量见表 5。

表5 Hcp-scFv的基因序列长度及编码蛋白预测分子量

图2 阳性克隆ELISA验证结果

表4 第4轮洗脱噬菌体单克隆验证ELISA的OD450值

2.2 重组质粒pET-30a-Hcp-scFv的构建

在A5、F11的上下游引物中分别加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点，G5、G8、D2、D10、H12的上下游引物分别加入Nco Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点，以提取的噬菌粒为模板，经PCR扩增，2%琼脂糖电泳观察，显示7个菌株均扩增得到约750 bp 的scFv 目的片段，扩增条带大小与目的基因大小一致(图3，图4)。将PCR产物克隆于载体pEASY-T中，挑取阳性克隆扩增培养后测序，使用DNAMAN 7.0软件对测序结果进行分析比对，与预期结果相符。将经限制性内切酶双酶切回收后的目的scFv片段与经对应限制性内切酶双酶切的表达载体pET-30a(+)连接，构建重组质粒pET-30a-Hcp-scFv，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。挑取阳性克隆提取质粒后进行双酶切鉴定，酶切结果如图5、图6所示，与预期相符，表明重组质粒pET-30a-Hcp-ScFv构建正确。

图3 scFv A5、F11基因的PCR扩增

图4 scFv G5、G8、D2、D10、H12基因的PCR扩增

图5 重组质粒pET-30a-Hcp-scFv的双酶切鉴定

图6 重组质粒pET-30a-Hcp-scFv的双酶切鉴定

2.3 重组蛋白的小量诱导表达及可溶性分析

阳性重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后小量诱导表达后，进行SDS-PAGE 检测，结果如图7所示，重组菌H12表达不稳定，重组菌 A5、F11、G5、G8、D2、D10在约33 kDa处都有一特异性蛋白条带，与预测的分子量一致。作为对照的未经诱导重组菌和诱导的空载体pET-30a(+)转化菌均无特异性条带，可见重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS得到了表达。经小量诱导表达实验，H12表达不稳定，故选择A5、F11、G5、G8、D2、D10做下一步实验。收集培养菌体超声裂解，离心后分别取等量上清液和沉淀，通过SDS-PAGE检测目的蛋白的可溶性，结果如图8～图10所示：重组菌F11、G8、D2、D10在沉淀裂解产物中有目标条带，故F11、G8、D2、D10以包涵体形式存在，重组菌A5、G5在上清液和沉淀裂解产物均有条带，但沉淀裂解产物蛋白含量明显高于上清液，说明A5、G5主要以包涵体形式存在。

图7 pET-30a-Hcp-scFv的诱导表达

图8 A5、F11的诱导表达

图9 G5、G8的诱导表达

图10 D2、D10的诱导表达

2.4 重组蛋白的纯化及Western Blot验证

收集大量诱导表达的重组菌，使用Buffer B缓冲液(尿素：480g·L-1，NaH2PO412 g·L-1, pH:8)对菌体进行裂解，经超声破碎后离心取上清液，用SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达情况。因表达的目的蛋白带有多聚组氨酸标签(His-tag)，可以利用亲和柱分离目的蛋白，获得的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果与预期目标一致，见图11。本实验使用目的蛋白上带有 His-tag对应的鼠一抗和山羊抗鼠二抗进行Western Blot，以检测目的蛋白与杀香鱼假单胞菌Hcp重组蛋白抗原结合能力。结果显示，如图12所示，目的蛋白与His-Tag鼠单抗发生特异性反应显示棕色，与SDS-PAGE电泳实验条带位置一致，证明该重组蛋白纯化后结构完整，说明杀香鱼假单胞菌Hcp重组蛋白的scFv 在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS中可以有效表达，通过纯化、透析得到的是有生物活性的目的蛋白。

图11 pET-30a-Hcp-ScFv的纯化

图12 pET-30a-Hcp-ScFv的Western Blot分析结果

3 讨论

细菌的分泌系统是病原菌逃避宿主免疫清除的关键[10]，Ⅵ型分泌系统(T6SS)存在于许多革兰氏阴性菌的毒力岛中，研究证实 T6SS分泌系统是假单胞菌分泌毒力的关键因子[11]。而溶血素共调节蛋白(Hcp)是病原菌对靶细胞产生生物学效应的重要的效应蛋白，被认为是T6SS的分子标志[12]。WANG等[13]用针对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)制备的重组Hcp疫苗免疫鲤(Cyprinuscarpio)，在攻毒实验中经免疫的鲤存活率明显提高。本研究以杀香鱼假单胞菌Hcp为抗原，从兔天然噬菌体文库中筛选出了针对杀香鱼假单胞菌Hcp的特异性scFv，并在E.coli系统中获得大量稳定表达，最终获得6个目的蛋白抗体，后续可以用于研究和开发以此为基础的大黄鱼内脏白点病诊断和检测试剂盒，因此，本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。

本文构建的7个重组子中，含A5、F11、G5、G8、D2、D10 的6个重组子在IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1、30℃条件下诱导表达，都获得了大量稳定表达的重组蛋白。而H12重组质粒酶切鉴定结果虽与预期一致，但重组子诱导表达不稳定，使用DNAMAN软件对H12编码的氨基酸序列进行分析，发现H12的基因序列中带有AGA、AGC、CGA等稀有密码子。有研究表明，稀有密码子的存在尤其是连续的稀有密码子可以降低蛋白质的翻译速率[14]。王光强[15]通过引入稀有密码子的方法成功抑制了耐热半乳糖苷酶的分泌表达，证明稀有密码子的存在会对蛋白表达产生影响，推测H12基因中稀有密码子的存在导致了H12重组子不稳定表达。

His 标签(His-tag)又称多组氨酸标签，由6～10 个连续的组氨酸残基组成，因His标签结构较小，对目的蛋白可溶性和生物学功能几乎没有影响。用His-tag制备的单抗可用来鉴定目的蛋白的相对表达量、分子量及目的蛋白在细胞中的定位。本实验中所用的表达载体pET-30a(+)带有His-Tag，利用这一特点，对实验获得的6个目的蛋白使用His-tag鼠单抗进行Western Blot验证，结果表明His-tag单抗能够特异性识目的蛋白。本研究中获得的6个重组蛋白大部分是以不可溶的包涵体形式存在，下一步将开展蛋白复性等研究，进一步提高重组蛋白针对杀香鱼假单胞菌的抗体活性。

噬菌体展示技术是一种高通量筛选技术，它依赖于细胞内基因的表达，受限于所建噬菌体展示文库大小，淘选目标抗体时会出现非特异性吸附现象，但是它不需要免疫动物即可获得大量目的抗体，耗时短且成本低，逐渐成为当前应用广泛的筛选技术之一[16-17]。基于该技术的scFv是一种最小的功能性抗体片段单元，分子大小仅为完整抗体的1/6，但可以保持抗体亲和性和特异性[18]。随着噬菌体展示技术的创建和发展，研究者可通过与相应靶抗原的富集从抗体库中快速高效地获取特异性抗体。理论上抗体库库容达到107pfu，便能够识别99%的抗原决定簇，而天然噬菌体抗体库的多样性至多可以达到1012pfu，几乎可以筛选到各种目标抗体[19]。孙丽娜等[20]用纯化的H5N1禽流感凝血素蛋白对容量为5×109的人源天然抗体库进行3轮淘选，获得的5株单链抗体均与H5N1禽流感凝血素蛋白特异性结合，且与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。本实验中的兔天然噬菌体scFv文库容量为1010pfu，通过4轮淘洗获得目标抗体，对富集的scFv进行ELISA验证，最终获得16株具有高特异性的scFv，表明该文库容量满足本实验要求。本研究实现了杀香鱼假单胞菌Hcp高特异性scFv 在大肠杆菌中的高效表达，为基因工程抗体制剂应用于大黄鱼病害的免疫防治与病原菌ELISA 检测试剂盒等的研制奠定了基础。