小麦种子健康度检测研究及应用

孙秀枝，张 丽，贾代成，孟 琳，罗汉民，陈凤龙，公丕峰*

（1.淄博市张店区农业技术服务中心，山东 淄博 255000；2.淄博市农业农村数字发展中心，山东 淄博 255000；3.淄博鲁中农作物研究所，山东 淄博 255000）

高质量种子是农业高产的基础，高质量种子应兼有优良的品种属性和良好的播种品质，其中播种品质是指种子的净度、水分、饱满度、发芽率、活力及健康度等[1]。目前市场上的农作物种子只对种子的净度、水分、发芽率和纯度4 项质量指标进行了规定，并以此来判断种子质量的高低。随着现代种业的发展，种子贸易日益频繁，种子质量评价的标准和内容不再满足于这4 项指标，种子健康度指标越来越受到重视，对种子健康度进行检验与控制势在必行[2]。

1 研究背景

1.1 国外研究概况

植物病害委员会（ISTA）是一个为国际种子健康检验制定通用标准方法的组织，其宗旨是确保健康的种子可以在全球范围内无障碍流通。目前，ISTA 共出版了64 本种传病害检验工作手册，其中14 种方法被纳入ISTA 规则中。

1917 年，Hiltner 观察到禾谷类种子，特别是燕麦种子的田间出苗率与实验室中测得的发芽率相差甚远，把这种现象归因于感染了Fusarium ni-vale 的种子生长力太弱，只能在适宜的实验室条件下发芽，而不能在田间出苗。

1928年，ISTA制定了第一部世界种子检验规程。种子检疫部分详细介绍了禾谷类作物中的Clavicep-spurpurea、Fusarium、Tilletia 和Ustilagohordei，豌豆中Ascochyta，菜豆中Colletotrichumlindemuthianum，亚麻中Botrytis、Colletotrichum linlcola 和Aureobasidumlini的检验。

1931 年，在ISTA 第六次代表大会上，ISTA 首任负责人L.C.Doyer 博士提出了“在国际种子检验规程中增加种子健康检验”的建议。随后，1938 年，L.C.Doyer博士主编了《种传病害检验手册》，第一次提出了检验和确认种传真菌、细菌、线虫和昆虫重复性较高的方法。

1993 年，ISTA 第一届座谈会在加拿大渥太华召开，主题是“种子健康检验中的质量保证”。第二届座谈会于1996 年在英国剑桥召开，主题是“种子健康检验——面向21 世纪的工程”，第三届于1999 年在美国依阿华召开，主题是“病害胁迫与其在种子健康检验中的作用”。

种子健康检验的组织与技术体系历经一个多世纪的发展，已成为世界种子贸易中质量控制的重要组成部分。

1.2 国内研究概况

我国对农作物种子健康度研究也经历了一个漫长的过程。1981 年，原农业部举办种子病理检疫讲习班，邀请Paul Neergard 来华讲学。1990 年，中国农业大学等高校设立本科生和研究生《种子病理学》课程。1993 年，中国农业大学设立种子科学系。1998 年12 月，在北京召开全国第一届种子病理学术研讨会，并成立中国植物病理学会（CSPP）种子病理学专业委员会（SPC），培训内容为“种子苗木病害的控制与种子预防保健”。1999 年7 月，印度V.G.Agarwal 来中国进行学术交流，对“小麦散黑粉病的整胚检验法”进行探讨。2001 年8 月，在昆明召开全国第二届种子病理学术研讨会，主题为“健康的种子 健康的生活”。2006 年8 月，在长沙召开全国第三届种子病理学术研讨会。1995 年国家技术监督局发布的《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.1—1995）中“其他项目检验”对种子健康度检验进行了简单概述，但可操作性不强。

2 研究意义及目标

种子健康度检测不仅为种子生产、调运提供切实可行的参考依据，还可指导农民科学用种，运用科学生态的病害防治方法全面提高种子质量，防止和控制种传病害[3]。

2.1 意义

2.1.1 种子贸易发展的必然要求

随着种子贸易国际化进程加快，种业市场竞争日益激烈，质量问题成为种子贸易的关键，常规的水分、净度、纯度和发芽率检验已不能满足种子贸易的需求，对种子健康度检测是非常有必要的。

2.1.2 为解决种子质量纠纷提供科学依据

近年来，因种子带菌引起的种子质量纠纷时有发生，特别是播种后苗期缺苗断垄现象，以及后期病害流行成灾，造成这些现象的主要原因是发芽率和种子病原问题，严重影响了农业生产和社会稳定。健康度检测能为解决种子纠纷提供科学依据，保护消费者的合法权益。

2.1.3 防止种传病害的需要

种传病害对农业生产的危害表现在以下方面。一是种子携带的病原体可以在植株从发芽到收获的任意阶段引起田间病害，降低作物的商品价值。二是种传病害可引起幼苗价值降低，引起发芽或田间出苗不良，产生不正常幼苗。三是病原可随种子批流转，种子带菌是远距离传播病害的重要途径。通过检测种子所携带病虫害种类及数量可以发现检疫性传染病害，确定种子批的使用价值，评定种子批是否需要经过种子处理，以及处理前后对发芽率的影响，提高种子质量[4]。

2.2 目标

2.2.1 跟踪评价全市小麦种子健康状况

通过研究，对淄博市不同区、县的小麦种子生产基地种子带菌情况进行跟踪评价，指导种子企业合理布局种子生产基地，科学处理带菌种子，有效阻止带病、带菌种子的传播。

2.2.2 研究制定小麦种子健康度检测技术操作规范

开展种子健康度检测，规范种子健康度检测方法，制定淄博市《小麦种子健康度检测技术操作规范》，虽然《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.1—1995）的“其他项目检验”对种子健康度检验进行了简单概述，但在实际操作中多数检测仅限于有害动物检测，对病原菌体检测较少。此项检测方法将是对《农作物种子检验规程》中“其他项目检验”的有力补充。

2.2.3 研究制订小麦病害高效防治措施

淄博市是重要的工业城市，环境污染问题突出。近年来，农药引起的环境污染问题也日益显现，通过配制应用高效种衣剂，实现从源头上防治种源病害，减少农业生产中农药的使用量，降低环境污染。

3 试验过程及分析

3.1 抽取试验材料

2013 年10 月从淄博市5 家种子企业10 个生产基地收集未经筛选的小麦种子样品17 个，2014 年9月从淄博市5 家种子企业10 个生产基地收集经过筛选的小麦种子样品18 个。试验培养对象为作物种子表面附带的真菌及内部寄藏的真菌。小麦种子外观完整，没有种皮破损的不完整粒。样品符合取样要求，并具有代表性。

3.2 制备PDA 培养基

先将马铃薯洗净去皮，称取100 g 马铃薯切成1 cm3的小块，加水约500 mL，煮沸30 min，称取葡萄糖10 g 放置在500 mL 烧杯中，用4 层纱布将马铃薯液过滤至广口瓶中，称取琼脂15～20 g 放至500 mL 三角瓶中，将溶有葡萄糖的马铃薯液倒入三角瓶中，摇匀，再补足水分至500 mL，加塞、封口。高压、121 ℃灭菌30 min 后取出，放置于超净工作台冷却。将灭菌冷却后的培养基倒入无菌的培养皿中，培养基层厚度以3～5 mm 为宜，待冷却凝固后备用。

3.3 菌种分离培养及形态学观察

3.3.1 菌种分离纯化

在超净工作台上对未经筛选的17 份小麦种子样品和经过筛选的18 份小麦种子样品，分别用0.1%升汞进行表面消毒10 min，再用无菌水进行洗涤（设6 个小烧杯，倒入无菌水，将消毒处理的小麦种子进行稀释洗涤，小麦种子在烧杯中滞留时间约10 s），用无菌滤纸吸干种子沾附的水分。将表面消毒处理后的小麦种子种胚处切去种皮，接种到培养基。每份样品设置8 个重复，每个重复100 粒。将接种好的培养基放置在20℃、黑暗条件下的培养箱内，培养7 d。

3.3.2 菌种形态学观察

采用组织分离法，对17 份未经筛选的小麦种子样品进行菌种的分离、纯化，获得3 种纯化的菌种；对经过筛选的18 份小麦种子样品进行菌种的分离、纯化，获得两种纯化的菌种。在28 ℃PDA 培养基条件下，用生物显微镜进行形态学观察。利用形态特征分析法，对菌落特征特性进行观察，与典型菌落特征进行比较，确定菌种类型为黄曲霉、黑粉菌和镰刀菌。

3.4 小麦种子带菌率测定

对收集的未经筛选的17 份小麦种子样品和经过筛选的18 份小麦种子样品，在无菌滤纸上进行培养，每个样品设置4 个重复，每个重复100 粒，观察筛选加工对小麦种子带菌率的影响。

观察发现，未经过筛选的小麦种子带菌率远远大于经过筛选的小麦种子带菌率。

3.5 菌种致病性测定

3.5.1 室内发芽试验

将直径0.6 cm 的菌饼置于28 ℃避光条件下，在PDA培养基上培养2 d。用2 块直径0.6 cm 不同菌种的菌饼分别与5 mL、10 mL、15 mL 和20 mL 无菌水配制不同接种量的菌液，分别用10 mL 不同接种量的菌丝悬浮液处理山农15 小麦种子5 min，然后将处理过的小麦种子放置于纸床上，在20 ℃的培养箱内培养7 d。设置一个空白对照处理，每个处理3 个重复，每个重复100 粒，从第四天开始，每天定时测定不同处理小麦种子的发病率。

1）黄曲霉处理。通过对不同浓度黄曲霉菌液处理下山农15 小麦种子发芽率的差异分析发现，用不同浓度黄曲霉菌液处理种子5 min 后，处理间的发芽率无显著差异。

2）镰刀菌处理。通过对不同浓度镰刀菌菌液处理下山农15 小麦种子发芽率的差异分析发现，用不同浓度镰刀菌菌液处理种子5 min 后，2 菌饼/5 mL 处理和2 菌饼/10 mL 处理与空白对照间的发芽率存在显著差异。

3）黑粉菌处理。通过对不同浓度黑粉菌菌液处理下山农15 小麦种子发芽率的差异分析发现，用不同浓度黑粉菌菌液处理种子5 min 后，用2 菌饼/5 mL 浓度菌液处理过的种子，发病情况较其他处理无显著差异，但幼苗长势较弱，与对照相比存在差异。

3.5.2 田间试验

将直径0.6 cm 的菌饼置于28 ℃避光条件下，在PDA 培养基上培养2 d。用2 块直径0.6 cm 的不同菌种的菌饼分别与5 mL、10 mL、15 mL 和20 mL 无菌水配制不同接种量的菌液，分别用10 mL 不同接种量的菌丝悬浮液处理山农15 小麦种子5 min，然后将处理过的小麦种子种植在鲁中农作物研究所试验田，设置1 个空白对照处理，每个处理3 个重复，每个重复用种量30 g，观察不同菌种处理后田间发病情况。田间种植观察中可以发现，接种浓度2 菌饼/5 mL 的不同菌种菌液，镰刀菌的致病效果明显，黑粉菌次之，黄曲霉与对照相比无差异。

3.5.3 确定致病性

在小麦生长期间，观察幼苗、秸秆及穗部发病情况。对上述室内发芽试验中出现的烂芽和田间的小麦病株进行采集取样，并对发病部位进行菌种分离纯化，根据柯赫氏法则确定获得菌种是否具有致病性。

幼苗病症特点：1）接种黄曲霉。室内幼苗发芽率与对照相比，无明显差异，幼苗正常。2）接种镰刀菌。用2 菌饼/5 mL 浓度菌液处理过的种子，幼苗染病，轻者能发芽，但生长细弱，严重的不能发芽；幼苗染病后在芽鞘上产生黄褐色斑，边缘清晰，中间稍褪色。3）接种黑粉菌。用2 菌饼/5 mL 浓度菌液处理过的种子，发病情况较其他处理无显著差异，但幼苗长势较弱，不正常幼苗与对照相比存在差异。

病株病症特点：1）小麦根部出现深褐色病斑，根部组织呈絮状纤维。2）麦穗中上部出现黑色病症。3）秸秆中下部出现同心圆环状褐色病斑。

对发病组织进行分离纯化后获得两种菌种，利用形态特征分析法确定两种菌种类型分别为黑粉菌和镰刀菌。根据柯赫氏法则确定镰刀菌和黑粉菌为小麦种子携带的致病菌，并分别引起了小麦茎基腐病和黑粉病。

4 取得的主要成果

4.1 确定了淄博市小麦种子基地带菌情况分布

通过对淄博市小麦种子生产基地生产的小麦种子健康度检测，小麦种子带菌率超过30%的样品产地主要集中在高青县，未经筛选加工的小麦种子带菌率远高于经筛选加工的小麦种子。

4.2 鉴定致病菌两种

采用组织分离法，对未经筛选的小麦种子样品进行菌种分离、纯化，获得3 种纯化的菌种，分别是黄曲霉、黑粉菌和镰刀菌；对经过筛选的小麦种子样品进行菌种分离、纯化，获得两种纯化的菌种，分别是黑粉菌和镰刀菌。根据柯赫氏法则要求，进行3 种病原菌的致病性测定，最终确定黑粉菌和镰刀菌为小麦种子携带的致病菌，分别引起小麦黑粉病和茎基腐病。

4.3 制定小麦种子健康度检测技术操作规范

通过对病原菌的分离、纯化，病原菌鉴定，致病性检测等技术研究及结果分析，制定了淄博市小麦种子健康度检测技术操作规范，为今后淄博市小麦种子健康度检测提供了技术支撑。

4.4 研究配制3 种高效小麦种衣剂

通过室内生物活性测定和田间试验，对8 种杀菌剂进行防治效果比对，最终筛选出3 种对小麦茎基腐病和黑粉病具有较好防治效果的种衣剂，分别是5%苯甲·戊唑醇种子处理悬浮剂、2%戊唑醇悬浮种衣剂、30 g/L 苯醚甲环唑悬浮种衣剂。

4.5 开展小麦种衣剂推广应用

将3 种高效小麦种衣剂在桓台县、临淄区和高青县通过种子企业进行推广应用，3 年累计推广面积达18.6 万hm2。