白芍总苷通过miR-23b-3p/FoxA1对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响

李玉磊 张瑞芳 刘莉敏

肺炎是全世界发病率和死亡率的主要原因，肺泡上皮细胞损害及炎症细胞浸润与肺炎的发展密切相关；研究表明，中医药能改善临床症状，减轻炎症反应，提高临床疗效[1-2]。白芍总苷是从中药白芍干燥根部提取的有效成分，具有广泛的抗炎和免疫调节作用[3]。研究报道白芍总苷可降低炎症程度，对慢性心力衰竭大鼠起保护作用[4]。白芍总苷可以有效调节炎症因子表达，减少结肠组织的炎症损伤[5]。白芍总苷通过调控凋亡相关蛋白表达，抑制氧化应激和炎症级联反应，进而抑制局灶性脑缺血后海马神经元损伤[6]。肺炎链球菌是导致社区获得性肺炎最主要的病原体，然而白芍总苷对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响及机制尚不清楚。研究报道重症肺炎患儿外周血中miR-23b-3p低表达，与病情加重、炎症反应激活有关[7]。miR-23b-3p靶向PALM3抑制肺炎链球菌诱导的A549炎症和细胞凋亡[8]。在线软件预测发现miR-23b-3p与叉头盒蛋白A1(FoxA1)有结合位点。而抑制叉头盒蛋白A1(FoxA1)表达可缓解脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤[9]。然而miR-23b-3p与FoxA1的关系，以及白芍总苷是否调控miR-23b-3p与FoxA1的表达也尚不清楚。本实验旨在研究白芍总苷对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响及机制是否与miR-23b-3p与FoxA1有关。

资料与方法

一、材料

肺泡上皮细胞A549、肺炎链球菌购自美国ATCC；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；白芍总苷胶囊(国药准字H20055058，规格：0.3g/粒)购自宁波立华制药有限公司；CCK-8试剂盒、凋亡检测试剂盒购自日本同仁研究所；IL-6、IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒、蛋白提取试剂盒购自上海研生实业有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司。

二、方法

1 细胞处理与分组 肺泡上皮细胞A549培养于RPMI-1640培养基中，取对数生长期细胞，用1×108CFU/mL的肺炎链球菌培养细胞，作为模型(Model)组，未经感染的细胞作为对照(Con)组；分别用17.5 mg/mL、35 mg/mL、70 mg/mL的白芍总苷处理A549细胞后，用1×108CFU/mL的肺炎链球菌感染，作为Model+白芍总苷低、中、高剂量组；将miR-23b-3p抑制剂转染A549细胞后，用70 mg/mL的白芍总苷处理，再用1×108CFU/mL的肺炎链球菌感染，作为Model+白芍总苷+anti-miR-23b-3p组。

2 CCK-8检测细胞活性 各组培养48 h的细胞，每孔中加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值(OD)。

3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，用预冷的PBS漂洗，加入400 μL的结合缓冲液重悬细胞；然后加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、IL-10水平 各组细胞培养48 h后取上清，具体按照试剂盒操作进，酶标仪检测各组OD450nm值；以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品OD值在标准曲线上查找相应浓度。

5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-23b-3p表达水平 提取细胞总RNA，反转录成cDNA，以U6为内参进行PCR扩增，95 ℃预变性2 min(1个循环)，95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(40个循环)，72 ℃延长5 min；相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。miR-23b-3p上游引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGGAT-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTGGTAAT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

6 蛋白质印迹法检测FoxA1蛋白表达 提取总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜，封闭液封闭1 h，加入FoxA1抗体(1 ∶800)4 ℃孵育过夜；加入二抗(1 ∶2 000)室温孵育2 h，用ECL发光液显影，分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算蛋白相对表达水平。

7 双荧光素酶报告实验 构建FoxA1的3′UTR野生型和突变型荧光素酶载体，将其分别与miR-NC或miR-23b-3p共转染至A549细胞，按照试剂盒说明书操作检测细胞的荧光素酶活性。

三、统计学分析

结 果

一、白芍总苷对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和细胞活性的影响

与Con组相比，Model组A549细胞活性降低，细胞凋亡率升高，IL-6含量升高，IL-10含量降低(P<0.05)；与Model组相比，Model+白芍总苷低、中、高剂量组A549细胞活性升高，细胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高，呈剂量依赖性(P<0.05)(图1)。

图1 白芍总苷抑制肺炎链球菌诱导A549细胞凋亡、提高细胞活性及对IL-6和IL-10含量的影响

二、白芍总苷对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中miR-23b-3p和FoxA1表达的影响

与Con组相比，Model组肺泡上皮细胞中miR-23b-3p表达水平降低，FoxA1蛋白表达水平升高(P<0.05)；与Model组相比，Model+白芍总苷低、中、高剂量组肺泡上皮细胞中miR-23b-3p表达水平升高，FoxA1蛋白表达水平降低，呈剂量依赖性(P<0.05)(图2)。

图2 白芍总苷对miR-23b-3p和FoxA1表达的影响

三、过表达miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡、细胞活性及IL-6和IL-10含量的影响

与Model组和Model+miR-NC组相比，Model+miR-23b-3p组miR-23b-3p表达水平升高，FoxA1蛋白表达水平降低，细胞活性升高，细胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高(P<0.05)(图3)。

图3 过表达miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡、细胞活性及IL-6和IL-10含量的影响

四、抑制miR-23b-3p对白芍总苷作用的肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡、细胞活性及IL-6和IL-10含量的影响

与Model+白芍总苷组相比，Model+白芍总苷+anti-miR-23b-3p组miR-23b-3p表达水平降低，FoxA1蛋白表达水平升高，细胞活性降低，细胞凋亡率升高，IL-6含量升高，IL-10含量降低(P<0.05)(图4)。

图4 抑制miR-23b-3p可逆转白芍总苷对肺炎链球菌诱导A549细胞凋亡、活性和IL-6和IL-10含量的影响

五、miR-23b-3p靶向FoxA1

Targetscan软件预测显示FoxA1的3′UTR含有miR-23b-3p的互补序列(图5)；wt-FoxA1与miR-23b-3p共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，而mut-FoxA1与miR-23b-3p共转染后细胞荧光素酶活性无显著变化。

图5 FoxA1和miR-23b-3p的互补序列及荧光素酶活性检测

讨 论

近些年研究表明，中医药治疗肺炎具有一定的优势和特色，因此开发新的中药对治疗肺炎具有重要意义[10]。研究报道白芍总苷能够通过抑制氧化应激和炎症反应而对动脉粥样硬化表现出一定的保护作用[11]。白芍总苷抑制XIST表达以调节miR-124-3p/ITGB1轴，从而减轻缺氧/复氧处理的肾细胞的凋亡和炎症[12]。白芍总苷通过降低炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平以及减少细胞凋亡来减轻大鼠的血脑屏障破坏和脑缺血/再灌注损伤[13]。本实验用肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞建立肺炎细胞模型，用不同浓度的白芍总苷处理，结果显示，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞的活性升高，细胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高，呈剂量依赖性；IL-6是促炎细胞因子，IL-10是抑炎细胞因子，因此，本实验结果表明，白芍总苷可浓度依赖性的抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应。

研究报道硫酸铍诱导的人支气管上皮细胞16HBE中miR-23b-5p表达下调[14]。miR-23b-3p调控脂蛋白(a)抑制同型半胱氨酸诱导的冠状动脉血管内皮细胞损伤[15]。本实验结果显示，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中miR-23b-5p表达水平降低，过表达miR-23b-3p后，细胞活性升高，细胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高；表明过表达miR-23b-3p可抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应。而且本实验发现，miR-23b-3p靶向调控FoxA1的表达。本研究报道脂多糖诱导的急性肺损伤过程中FoxA1上调表达[16]。抑制FOXA1表达能减轻LPS诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC凋亡并促进其增殖[17]。沉默lncRNA H19通过调节miR-423-5p/FoxA1轴减轻肺损伤，炎症和急性呼吸窘迫综合征的纤维化[18]。本实验结果显示，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中FoxA1蛋白表达水平升高。而过表达miR-23b-3p可降低FoxA1的表达。因此，表明miR-23b-3p可能通过调控FoxA1影响肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应。本实验结果还发现，白芍总苷处理后，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中miR-23b-3p表达水平升高，FoxA1蛋白表达水平降低。而抑制miR-23b-3p可逆转白芍总苷对肺炎链球菌诱导A549细胞凋亡、活性和IL-6和IL-10含量的影响。

综上所述，白芍总苷通过调控miR-23b-3p/FoxA1轴抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症。