一株多黏类芽胞杆菌 Paenibacillus polymyxa 菌株P1防治广东菜心根肿病的研究

张莹莹 郝文娟 李宏玉 马艳 毛伟力

摘要

蕓薹根肿病是一种危害极大的世界性病害。对此病害的防治多采用化学药剂，但过多地使用化学农药，不仅会导致病原菌的抗药性和药剂防效的不稳定，还会造成环境污染和食品安全等问题。筛选生防菌株并将其开发成有效的生物农药，是防治根肿病并保持绿色农业可持续发展的新途径。本研究选用了多种生防菌对芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae Woron.的休眠孢子进行拮抗测试，筛选出一株能抑制P.brassicae休眠孢子萌发的多黏类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa菌株 P1。通过液体发酵和剂型处理，将P1制成悬浮剂（P1SC），用于室内生测和大田试验，测定其对广东菜心根肿病的防治效果。盆栽试验结果表明，对菜心根肿病的防治效果与所使用的P1SC浓度呈正相关，当施用P1SC 中P1的浓度≥1×106 cfu/mL时，对菜心根肿病的防治效果（83.0%）与化学农药氟啶胺（500 mg/L）的防治效果（100.0%）没有显著性差异，但显著高于（P≤0.05）一种商品枯草芽孢杆菌（2×107 cfu/mL）的防治效果（29.8%）。 2018年的大田试验结果表明，P1SC处理（4 L/667m2）对菜心根肿病的防治效果（53.3%）显著高于（P≤0.05）枯草芽孢杆菌处理（2 kg/667m2，30.9%），与500 g/L氟啶胺SC（500 mL/667m2）的防治效果（44.6%）没有显著差异（P≤0.05）;而在2019年，P1SC处理对菜心根肿病的防治效果（62.4%）显著高于（P≤0.05）500 g/L氟啶胺SC（34.6%）和枯草芽孢杆菌处理（31.4%）。

  关键词

十字花科;芸薹根肿菌;休眠孢子;多黏类芽胞杆菌;防治效果

中图分类号：

S476

文献标识码：B

DOI：10.16688/j.zwbh.2020644

Control effect of Paenibacillus polymyxa P1 strain against cabbage clubroot in Guangdong

ZHANG Yingying1，HAO Wenjuan1，LI Hongyu2，MA Yan2，MAO Weili1*

（1. Shanghai Wanlihua Biotech Corporation， Shanghai201203， China;

2. Dali Plant Protection Station， Yunnan Province， Dali671000， China）

Abstract

Clubroot is a worldwide and harmful disease. Chemical pesticides have been used to control the disease， however， excessive use of chemical pesticides will lead to the resistance of the pathogen and instable control effect of the pesticides，and cause the problems of environmental pollution and food safety. Screening and developing biocontrol agents are necessary for clubroot control and sustainable development of green agriculture. In this study， a variety of biocontrol agents were selected to test their inhibition activity on dormant spore germination of Plasmodiophora brassicae Woron. A strain P1 of Paenibacillus polymyxa was selected， with good inhibiting effect on germination of the dormant spores. Through the processes of fermentation and formulation， a suspension concentrate was made containing P1 （P1SC）， and the control effect against the clubroot of Guangdong cabbage （CGC） was investigated by indoor pot experiment and field test. Pot experiment revealed that there was a positive correlation between the concentration of P1SC applied and the control effect. When the content of P1 spores in  P1SC applied was ≥1×106 cfu/mL， there was no significant difference （P≤0.05） on the control effect of CGC between the treatments of P1SC （83.0%） and the chemical pesticide fluazinam （500 mg/L， 100.0%）， but significantly higher （P≤0.05） than that of a commercial formulation with a strain of  Bacillus subtilis （2×107 cfu/mL， 29.8%）. Field experiments in 2018 showed that the control effect of P1SC （4 L/667m2，  53.3%） on CGC was significantly higher （P≤0.05） than that of B. subtilis （2 kg/667m2， 30.9%）， but similar to that of 500 g/L  fluazinam SC （500 mL/667 m2， 44.6%）. The results of 2019 showed the control effect of P1SC on CGC （62.4%） was significantly higher （P≤0.05） than that of fluazinam （34.6%） and B.subtilis （31.4%）.

Key words

Cruciferae;Plasmodiophora brassicae;dormant spore;Paenibacillus polymyxa;control effect

芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae Woron主要侵染十字花科作物并引起根肿病。早在1737年根肿病已出现在地中海西岸及欧洲南部，目前已成为一种世界性的严重影响十字花科作物产量的土传病害[1 3]。根肿病在中国大部分地区均有发生，约有320～400万hm2的耕地常年受到根肿病的侵染。P.brassicae主要侵染作物根部，形成大小不一、光滑或龟裂粗糙的肿瘤，影响根系生长及对水分、养分的吸收，导致地上部分黄化、萎蔫、生长迟缓，甚至死亡，可造成20%～60%的减产和经济损失[4 5]。在无十字花科寄主的情况下，P.brassicae的休眠孢子可在土壤中存活长达20年之久[1]。一旦土壤带菌，在很长一段时间内该地块不能再种植十字花科作物。由于根肿病的传播速度快，途径广，在防控上十分困难。

目前国内外对根肿病的防治主要采用化学药剂，例如氟啶胺、氰霜唑、多菌灵、百菌清等。但长期使用化学药剂，会造成P.brassicae的抗药性增强、防效不稳定，并会产生大量的农药残留，不利于绿色生态农业的发展。通过施用石灰调节土壤pH可降低根肿病的发病率[6]， 但大量施用石灰会改变土壤的物理结构和理化性质，因此也不宜长期施用。生物防治对环境和人畜无害，且不易产生抗药性，国内外科研人员利用生物农药对根肿病的防治进行了大量的研究，并取得了一定的成效。王保通等[7]选用一种解淀粉芽胞杆菌生物制剂（Ba168）对甘蓝根肿病的防治进行了温室试验，结果显示，其防治效果在79.84%～81.24%。何有为[8]从土壤中分离出两株芽胞杆菌F85和T133，對P.brassicae的休眠孢子侵染油菜根毛有抑制作用，F85和T133的盆栽试验防效均在60%以上。Cheah等[9]在花椰菜温室和田间试验中发现，3个木霉菌株Trichoderma spp. （TC32，TC45和 TC63） 和1个链霉菌Streptomyces sp. （S99） 均对根肿病有抑制作用。

目前全球已登记的，含不同有效成分的生物农药有上千个产品。仅以木霉为产品活性成分的杀菌剂就有300多个[10]。在许多发达国家，如：美国、加拿大、日本、欧盟、澳大利亚、以色列等，生物农药使用量已从20世纪90年代初的 <5%，到目前的接近或 >20%的全年农药使用总量。在发展中国家，例如：巴西、印度、中国、越南等，生物农药的使用量也有了显著的提升[10 11]。我国在生物农药领域的研究起步虽早，但总体发展较慢且不均衡。直到本世纪初，在国家的大力倡导和支持下，生物农药的研究与产业化有了平衡而快速的发展[12 13]。2001年我国注册登记的生物农药品种只有80个，产品694个（其中大多为农用抗生素类产品），到2018年，我国注册登记的生物农药，包括微生物、植物源和生物化学类，产品数达1 366个[14]。据不完全统计，我国生物农药的使用量已从2010年前的<5%，上升到目前接近或>10%的全年农药总使用量。

本研究通过拮抗试验，筛选出一株对P.brassicae休眠孢子萌发有抑制作用的Paenibacillus polymyxa菌株P1。将其制成多黏类芽胞杆菌悬浮剂（P1SC）后，在室内生测及大田试验中评价其对根肿病的防治效果。

1材料与方法

1.1供试材料

供试菌株：20株木霉属真菌、10株芽胞杆菌属细菌（表1），由上海万力华生物科技有限公司分离保存。

培养基：真菌用PDB培养基，细菌用NB培养基。

供试菜心Brassica campestris L.ssp. chinensis var. utilis Tsen品种：‘四九菜心’，青县纯丰蔬菜良种繁育场。

供试药剂：2×108 cfu/mL P1SC，上海万力华生物有限公司;500 g/L氟啶胺悬浮剂（SC），先正达集团;100亿个/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（WP），云南星耀生物制品有限公司。

1.2芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液的制备

称取10 g菜心根肿组织洗净，置于24℃室内腐烂5 d，加入100 mL蒸馏水，用组织研磨机搅成匀浆，8层纱布过滤，滤液2 000 r/min离心5 min，重复3次。将沉淀溶于100 mL蒸馏水中，制成浓度为1×108个/mL的芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液，冷藏于4℃冰箱备用。

1.3拮抗微生物培养液的制备

将生长在斜面培养基上的拮抗菌株，分别接入含有100 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，置于28℃，200 r/min的摇床上培养（真菌5 d，细菌2 d），镜检后，用无菌水稀释制成浓度为1×108 cfu/mL拮抗菌培养液。

1.4根分泌物的收集

因为根肿病菌的休眠孢子不能在植物体外进行培养，所以收集广东菜心根分泌物充当寄主，以便对病原菌休眠孢子进行离体测试。菜心种子经 5.25%次氯酸钠表面消毒后，在28℃下催芽2～3 d;将出芽的种子播种到含有500 mL Hoagland营养液的容器中，在（28±2）℃的培养箱中，L∥D=12 h∥12 h培养7 d后，纱布过滤收集根分泌物，经过微孔滤膜（孔径0.22 μm）滤除细菌后4℃保存备用。

1.5拮抗菌抑制P.brassicae休眠孢子萌发的筛选

分别吸取0.5 mL P.brassicae休眠孢子悬浮液和拮抗菌培养液，移至含有3 mL灭过菌的根分泌物的离心管中，以无菌水代替拮抗菌培养液为空白对照，24℃黑暗培养5 d，镜检观察孢子萌发率，重复3次。

采用地衣红法[15]判定休眠孢子的萌发。用1%地衣红染色剂（45 mL醋酸与55 mL蒸馏水混合，加热，缓慢加入1 g地衣红粉末，搅拌溶解后缓慢煮沸2 h，过滤后储存在棕色瓶中备用）染色3 min后观察，着色的为未萌发的休眠孢子，未着色的为萌发的孢子。

休眠孢子萌发率=处理前孢子萌发率-处理后孢子萌发率;

休眠孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100%。

1.6P1SC防治菜心根肿病室内生测

选取直径10 cm的营养钵，装入营养土（草炭 ∶珍珠岩 ∶蛭石=7 ∶1 ∶2），移栽生长情况一致的两叶期菜心苗。移栽当天每钵加入2 mL P.brassicae休眠孢子悬浮液（1×107 cfu/mL）。将P1SC配制成5个浓度：1×105， 5×105， 1×106，5×106， 1×107 cfu/mL。 其他药剂处理为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂稀释500倍;500 g/L氟啶胺悬浮剂稀释1 000倍;清水空白对照。采用灌根法，分别在移栽当天、7 d以及14 d后，将各处理药剂浇灌于作物根部，每钵50 mL。每个处理5钵， 设3次重复。种植40 d后，统计根肿病发病情况。

菜心根肿病病害分级标准[16]：0级：无任何肿瘤;1级：主根肿大，其直径小于2倍茎基，或须根有小肿瘤;3级：主根肿大，其直径为茎基的2～3倍;5级：主根肿大，其直径为茎基的3～4倍;7级：主根肿大，其直径为茎基的4倍以上，或植株死亡。

1.7P1SC防治根肿病大田试验

2018年和2019年的大田试验在上海浦远农场进行，种植方式为撒种直播并适时间苗。在菜心出苗前，用春丰8HA电动喷雾器对土壤表面进行不同处理的喷雾施药;菜心出苗（两叶菜心）后，对不同处 理进行叶面喷雾，每隔7 d一次，共3次。試验设4个处理：a. P1SC用药量为： 4 L/667m2;b. 氟啶胺SC用药量为：500 mL/667m2;c. 枯草芽孢杆菌WP用药量为：2 kg/667m2;d. 清水对照。每个处理20 m2，3次重复，随机排列，用水量为50 L/667m2。 成熟期采收后统计发病情况。

菜心根肿病病害分级标准[17]：0级，无病害症状;Ⅰ级，仅须根末梢上有少量肿瘤;3级，侧根上有肿瘤;5级，侧根肿瘤大且主根末梢有小的肿瘤;7级，主根全部肿大，但植株生长正常;9级，根上肿大部分开始龟裂腐烂、植株萎蔫或死亡。

由于盆栽试验是在可控的特定条件下进行，菜心根部的生长环境与同时期的田间试验的环境有所不同，因此盆栽试验和田间试验分别采用不同的分级标准[18]。试验结果可靠且对结果的比较没有影响。

1.8数据处理

试验数据使用Excel整理，采用SPSS 23对数据进行单因素ANOVA分析。

2结果与分析

2.1拮抗菌抑制P.brassicae休眠孢子萌发的测试结果

试验结果表明（表2）：拮抗真菌TR04、TR13和细菌P1、P2、P7对P.brassicae休眠孢子萌发的抑制率均在50%以上，其中P1的抑制率高达71.3%，该处理的P.brassica休眠孢子萌发显著低于（P≤0.05）其他处理孢子的萌发率。

2.2P1SC防治菜心根肿病室内生测结果

室内生测结果表明（表3，图1），P1SC对菜心根肿病的防治效果与用药浓度呈正相关。 当施用P1SC  中的P1的浓度≥1×106 cfu/mL时，对菜心根肿病的防治效果为83.0%，与化学农药500 mg/L 氟啶胺SC的防治效果（100.0%）没有显著性差异，但显著高于（P≤0.05）一种商品枯草芽孢杆菌（2×107 个/mL）的防治效果（29.8%）。

2.3大田试验结果

2018年的大田试验结果表明（表4，图2），P1SC处理（4 L/667m2）对菜心根肿病的防治效果（53.3%）显著高于（P≤0.05）枯草芽孢杆菌处理（2 kg/667m2，30.9%），与氟啶胺（500 mL/667m2）的防治效果（44.6%）没有显著差异;而在2019年，P1SC处理对菜心根肿病的防治效果（62.4%）显著高于（P≤0.05）氟啶胺（34.6%）和枯草芽孢杆菌处理（31.4%）。

3讨论

多黏类芽胞杆菌作为一种生防菌，已广泛应用于植物病害生物防治。Kavitha等[19]发现多黏类芽胞杆菌 VLB16 抑制稻瘟病菌Pyricularia oryzae 和水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani的生长。刘晶晶等[20]筛选出5株多黏类芽胞杆菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6），通过释放挥发性物质来抑制茄子黄萎病菌Verticillium spp. 的生长。另外多黏类芽胞杆菌还对人参黑斑病菌Alternaria panax、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum和苹果树腐烂病菌Valsa ceratosperma 等有较好的拮抗效果[21 25]。但是，使用多黏类芽胞杆菌防治十字花科根肿病还鲜有报道。本研究的室内生测试验以及2年的大田试验结果表明，P1可以抑制P.brassicae休眠孢子的萌发，P1SC能较好地防控菜心根肿病，其防控效果与化学农药氟啶胺接近（2018年），或超过氟啶胺的防控效果（2019年）。

生防菌的开发利用，为解决十字花科根肿病问题提供了新的思路。 多数生防菌在室内盆栽试验的防效高于大田试验。究其原因可能是目前的生物菌剂有效成分为活体微生物，田间应用时易受温度、湿度、土壤pH等环境条件的影响，从而降低了生防菌对根肿病菌的拮抗作用[26]。如何高效、稳定地防治根肿病是目前生防菌研究的主攻方向。本研究两年大田试验结果表明，P1SC的大田防效相对稳定。但是能否长期稳定地防治根肿病还需要大量的研究来证明。

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收稿日期：2020 12 03修订日期：2021 01 27

基金项目：

大理州毛伟力专家工作站（大科联发[2019]6号）

* 通信作者

Email：weilimao@hotmail.com