固相支持液液萃取-GC-MS结合化学计量学鉴别云南和津巴布韦烟草提取物

张 华，王晨辉，李 炜，刘 琪，张 媛，秦艳华，朱怀远，廖惠云

江苏中烟工业有限责任公司，南京市建邺区兴隆大街29号 210019

烟草提取物（含浸膏、净油和酊剂等）是烟用香精香料的主要原料之一，其中，云南和津巴布韦烟草提取物是卷烟调香中常用的两类香原料［1-2］。云南烟草提取物具有沁人心脾、令人愉悦的清甜香，津巴布韦烟草提取物具有甜润、醇和的自然香韵，在卷烟配方中均具有调香、调味和提质的功能［3-4］。云南与津巴布韦烟草提取物香气成分组成较为相似，但相关差异性研究基本处于空白状态［5-6］。目前对烟草提取物的研究更多是从香韵角度进行感官评价［7］，易受经验、主观判断所制约，缺乏客观量化依据，难以对不同产地烟草提取物信息进行深入研判［8-9］。鉴于云南、津巴布韦及其他产地烟草提取物在卷烟用功能性香基模块中应用广泛，需要对其产地、组分及感官功效等进行针对性研究，以便于卷烟企业开展自主调香工作［10］。

烟草提取物来源广泛、成分较为复杂，除了含有易挥发香味组分外，也含有植物蜡、色素和糖类等难挥发组分［11-12］。在样品分析前处理过程中，相较于传统液液萃取，固相支持液液萃取（Solid-phase supported liquid-liquid extraction，SLE）是一种新型前处理方法。SLE 采用经过处理的硅藻土为吸附剂，具有吸水性强、性质稳定及不存在乳化现象的特点，能够提高分析结果的重现性及降低前处理过程的损失，已成功应用于医药、食品和环境等领域的样品前处理［13-15］。与此同时，近年来非靶向代谢组学手段在食品领域的产地溯源［16-17］、品质鉴别［18-19］和掺假鉴别［20-22］等方面应用广泛，具有明显技术优势，这为利用物质的组分对烟草提取物产地鉴别研究提供了参考［23-24］。为此，本研究中使用SLE-GC-MS 方法，结合非靶向代谢组学分析中常用的化学计量学方法，对云南、津巴布韦及其他产地烟草提取物样品中挥发性和半挥发性组分进行检测分析，筛选出可用于识别样品来源的有效指标，构建预测模型实现对未知烟草提取物的产地溯源，旨在为增强天然香原料属性认知和提升自主调香核心技术掌控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

83个国内外不同产地烟叶制备的烟草提取物样品（由郑州烟草研究院提供，其中，云南烟草提取物12个，津巴布韦烟草提取物22个和其他烟草提取物30个，分别简称YN、JBBW和QT，且QT样品主要包括河南、湖南、巴西和弗吉尼亚等国内外烟草提取物），以及用于模型预测的19个不同产地烟草提取物，样品常温密封保存。

乙醇（AR 级，国药集团化学试剂有限公司）；二氯甲烷（HPLC 级，美国Tedia 公司）；正十七碳烷（标准品，≥99%，比利时Acros 公司）；正构烷烃C7～C40（1 000 mg/L的正己烷溶液，上海安谱实验科技股份有限公司）；实验用水为GB/T 6682—2008 规定的一级水（电阻率＞18.2 MΩ·cm）；ProElutLLE 液液萃取柱［5 g/（10 mL），北京迪科马科技有限公司］；离心管（5 mL，PP材质，美国Corning公司）。

8890-5977B 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；Milli-Q Reference 超纯水系统（美国Millipore公司）；ME204电子天平（感量0.000 1 g，美国Mettler Toledo 公司）；EOFO-945617 数显型多管涡旋混合器（美国Talboys公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 溶剂萃取

称取0.2 g烟草提取物样品于5 mL离心管中，再准确移入50 μL浓度为1 000 μg/mL的正十七碳烷乙醇溶液；然后分别加入1.0 mL纯水和1.0 mL乙醇，使用涡旋混匀器于1 500 r/min 条件下分散20 min，得样品萃取液。

1.2.1.2 固相支持液液萃取

先对ProElut LLE+硅藻土固相萃取柱进行活化，即用10 mL 甲醇去杂质，排干液体；然后将样品萃取液全部转入已活化过的固相萃取柱，同时用浓缩瓶接收洗脱液，待上样溶液全部流入小柱上筛板后，静置平衡约5 min；随即用30 mL二氯甲烷分3次对固相萃取柱进行淋洗，并收集所有淋洗液；最后在50 ℃、常压条件下，将淋洗液浓缩至1 mL左右，再将其转移至2 mL色谱瓶中进行GC-MS分析。分析条件：

色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气：高纯氦气（≥99.999%）；进样口温度：250 ℃；柱流量：1 mL/min（恒流模式）；进样量：1 μL；分流比：5∶1；程序升温：电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围：35～550 amu；溶剂延迟：5 min。

1.2.2 定性定量方法

采用组分在质谱库NIST17和FLAVOR2中匹配度≥85%的方法进行定性分析，同时参照文献［25］的方法计算保留指数（Retention index，RI），并与文献资料相关化合物保留指数进行比对（通过webbook.nist.gov、www.flavornet.org 以及标准谱库等进行查找），将绝对值相差20以内的确定为同一化合物。

采用内标法定量，通过内标物的峰面积和样品溶液中各组分的峰面积比值，按公式（1）计算各个组分的相对质量浓度：

式中：Ci为待测组分的质量浓度，μg/mL；Ai和As为待测组分i 和内标化合物的色谱峰面积；V为待测样品溶液的体积，mL；Ws为加入内标化合物的质量，μg。本实验中假定各待测组分i的相对校正因子均为1。

1.2.3 数据处理

利用Agilent MassHunter Unknowns Analysis B10.1 软件解卷积处理质谱原始数据，导出转换为cef 格式文件，再导入到Agilent MassHunter Mass Profiler（MPP）15.1软件中进行峰识别、峰对齐、过滤（在所有样品中出现50%以上）等前处理，获得质量高的样品目标组分数据矩阵；利用SIMCA-P 14.1软件对数据矩阵进行中心化和归一化处理后进行主成分分析（Principal components analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）和变量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）值分析，并利用SPSS 26.0 软件进行方差分析，筛选出组间存在显著性差异的化合物；采用metaboanalyst（http：//www.metaboanalyst.ca）在线方式绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 分析方法重复性验证

烟草提取物大多呈半流体状态且非常黏稠，加香时常采用混合溶剂使样品基质分散，萃取液中含有部分水分，直接进行GC-MS分析会严重影响微量香味成分的定量分析。因此，必须进行溶剂转换，即采用含硅藻土的固相萃取柱进行萃取，使用二氯甲烷洗脱出目标组分，而水、色素大分子以及杂质颗粒等被保留在SPE柱填料中。考虑到样品处理过程较为复杂，对样品分析过程的稳定性和数据的可靠性进行监测，评估分析方法的重复性和稳定性。为此，分别以典型云南烟草提取物和津巴布韦烟草提取物为对象，按照上述样品前处理方法分别隔日进行3次处理，样品的GC-MS 总离子流色谱图如图1所示，计算共有色谱峰相对于内标色谱峰质量分数比值的相对标准偏差（RSD），考察分析方法的重复性。依据匹配度≥85%的原则，云南烟草提取物中共鉴定出151个共有色谱峰，其中，有132个组分质量分数的RSD 介于0.17%～9.26%之间，其余19个组分介于10.52%～18.21%之间；津巴布韦烟草提取物中共鉴定出162个共有色谱峰，其中，有135个组分质量分数的RSD 介于0.24%～9.65%之间，其余17个组分介于11.93%～19.01%之间。以上结果表明，所有组分的RSD 均小于20%，对于微量目标组分的量化分析而言，该方法具有较好的稳定性和重复性，所采集的数据可用于进一步研究和分析。本研究中通过多元数据分析造成的数据误差是由样品本身差异造成的，而非系统或分析造成的。

图1 典型云南（a）和津巴布韦（b）烟草提取物的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of typical tobacco extracts from Yunnan（a）and Zimbabwe（b）

2.2 烟草提取物挥发性、半挥发组分分析

对3组烟草提取物中挥发性、半挥发化合物进行定性分析的结果见表1。可知，3组烟草提取物样品中共鉴定出125个挥发性、半挥发性成分，其中除烟碱外，还包括醇类化合物19个、酯类26个、醛类4个、酮类22个、酸类7个、烷烃类19个、烯烃类3个、酚类5个、胺类8个、醚类2个和其他类化合物9个。从化合物官能团分类看，①YN样品中分离鉴定出的烟碱（64.34%，质量分数，下同）、酯类（9.36%）和胺类（9.09%）化合物质量分数较高，三者在YN 样品中所占比例约为82.79%；酮类（4.74%）、酸类（4.27%）、醇类（3.63%）、烯烃类（1.64%）、其他类（1.18%）和烷烃类（1.04%）等相对较低；酚类（0.37%）和醚类（0.05%）基本上可忽略不计。其中，除质量分数最高的烟碱外，芥酸酰胺（7.21%）、棕榈酸（3.77%）、东莨菪内酯（3.31%）、丙烯酸十二酯（2.59%）、新植二烯（1.57%）和9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮（1.31%）的相对质量分数均在1%以上。②JBBW样品中分离鉴定出的烟碱（49.99%）、醇类（16.17%）和酯类（13.18%）化合物的质量分数较高，三者在JBBW 样品中共约占79.34%；胺类化合物的质量分数也相对较高，达8.87%；其余则是酮类（3.04%）、醛类（2.03%）、酸类（1.99%）、其他类（1.47%）、烯烃类（1.19%）和烷烃类（1.10%）化合物；酚类（0.85%）和醚类（0.07%）的质量分数较低。其中，除质量分数最高的烟碱和溶剂丙二醇（7.96%）外，芥酸酰胺（7.40%）、乳酸乙酯（5.11%）、O-（4-丁基苯甲酰基）-O'-（异丁氧羰基）-1，2-苯二醇（3.61%）、5-羟甲基糠醛（1.99%）、乳酸甲酯（1.88%）、丙烯酸十二烷基酯（1.78%）、棕榈酸（1.65%）、东莨菪内酯（1.51%）、肼基甲酸乙酯（1.31%）、新植二烯（1.15%）和一缩二丙二醇（1.12%）的相对质量分数较高。③QT样品中烟碱（59.36%）、酯类（12.48%）和胺类（8.07%）化合物的质量分数较高，三者共占约83.62%；醇类（6.83%）化合物的质量分数也相对较高；其余为酮类（4.04%）、酸类（2.36%）、烯烃类（1.73%）、酚类（1.66%）和其他类（1.53%）化合物，醛类（0.90%）、烷烃类（0.89%）和醚类（0.15%）化合物的质量分数极低。其中，除质量分数最高的烟碱外，芥酸酰胺（7.12%）、棕榈酸乙酯（4.08%）、东莨菪内酯（2.93%）、棕榈酸（1.75%）、丙烯酸十二烷基酯（1.74%）、豆甾醇（1.73%）、新植二烯（1.68%）和α-生育酚（1.38%）的相对质量分数均在1%以上。由以上结果可见，3 组烟草提取物中所鉴定出的挥发性、半挥发性化合物的种类和相对质量分数差异明显，有利于后续探寻不同组烟草提取物产地鉴别。

表1 不同烟草提取物样品挥发性和半挥发性成分测定结果Tab.1 Results of volatile and semi-volatile components in different tobacco extract samples

表1（续）

表1（续）

表1（续）

2.3 烟草提取物产地鉴别

2.3.1 主成分和聚类热图分析

在对不同烟草提取物挥发性、半挥发性成分的相对质量分数总体分析的基础上，采用无监督的PCA 进行分析，结果如图2所示。根据PCA 结果，2个PC 成分贡献率仅占方差的30.4%（其中，PC1 为16.9%，PC2为13.5%），不能反映出样品的总体特征，而模型的Q2也仅为0.204，远小于0.5，说明模型并不可靠。3 组烟草提取物样品大部分均在95%置信椭圆内，分布较为无序，部分组样品之间更是交叉在一起，个别样品还位于95%置信椭圆外，无法反映不同组样品之间的差异。

图2 不同烟草提取物的主成分得分图Fig.2 PCA score plot of different tobacco extracts

热图具有能够直观展示重大研究对象的表达数据量差异变化情况的优势，可缩小主观判断的误差［9］。因此，为分析不同组烟草提取物样品之间的差异，采用metaboanalyst 在线方式对3 组烟草提取物进行聚类热图分析，结果如图3所示。在热图中，每一行代表了一种挥发性物质，颜色由蓝变红代表质量分数由低到高，反映出各挥发性成分在不同烟草提取物中质量分数的差异。可知，3组烟草提取物样品分布较为紊乱，部分YN和部分JBBW组内样品分别各自聚集在一起，样品相互交叉聚合，且与QT 组样品间隔聚合，说明不同产地烟草提取物挥发性和半挥发性成分种类及质量分数变化较为复杂，不具有明显的组间聚集规律，这与主成分分析的结果相对应。因此，有必要进一步对不同烟草提取物中挥发性、半挥发性组分进行OPLS-DA筛选研究。

图3 不同烟草提取物的聚类热图Fig.3 Cluster heat map of different tobacco extracts

2.3.2 OPLS-DA分析和产地预测

进一步采用OPLS-DA对YN、JBBW和QT样品进行分析，以考察YN、JBBW和QT样品之间的差异特征挥发性成分。OPLS-DA 是一种基于正交偏最小二乘回归算法的有监督模型，能够对数据降维并将无关的信号过滤去除，达到准确区分组间差异的目的，实现复杂数据的可视化、判别分析和预测［27］。由模型得分情况（图4a）可知，基本上所有样本均在95%置信区间内，极个别样品处于置信区间附近，JBBW 样品主要分布在左侧象限，QT 和YN 样品分别位于右侧象限上下两端，显示不同组样品能够得到有效区分。使用有监督的OPLS-DA 时容易产生过拟合现象，因此，又采用200次响应的置换检验验证分析模型是否有过拟合现象。如图4b所示，置换检验得到的R2=0.837，Q2=-0.778，Q2于Y 轴的截距是负值，说明此模型没有过拟合现象，模型预测能力好，可用于后续的不同样品组间差异特征挥发性成分筛选。

OPLS-DA 因子载荷图可直观地反映出每一个变量在得分图上的贡献［18］。对不同烟草提取物中主要挥发性和半挥发性成分进行分析，结果如图4c 所示。区别于JBBW 和QT 样品，A4（丝氨醇）、B4（γ-丁内酯）、D1（4-环戊烯-1，3-二酮）、D7（2，2，5-三甲基-3，4-己二酮）、D9（2，5-二甲基-3-己酮）、H2（菜籽多酚）、F13（1-碘十二烷）、G1（4-乙酰氧基-3-甲氧基苯乙烯）、K7（2-苄基硫基-4-甲氧基苯甲腈）等成分是凸显YN样品特征的物质组分；区别于YN和QT样品，B1（乳酸乙酯）、F19（3-甲基三十一烷）、A7［2-（2-羟基丙氧基）-1-丙醇］、A8（一缩二丙二醇）、B13（5-羟基戊酸2，4-二叔丁基苯酯）等成分是凸显JBBW样品特征的组分，以酯类和醇类较为突出；区别于YN 和JBBW 样品，H5（α-生育酚）、K1（2-羟基-5-甲基吡啶）、B3（1-羟基-2-丙基乙酸酯）、E2（乙酰丙酸）、D19（6，7-二甲氧基-1，4-二氢-2，3-喹喔啉二酮）、D6［5-（羟甲基）二氢呋喃-2（3H）-酮］和D2（2-吡咯烷酮）等成分是QT组烟草提取物的特征组分。

图4 不同烟草提取物的OPLS-DA图Fig.4 OPLS-DA plots of different tobacco extracts

OPLS-DA 模型不仅能够验证3 组烟草提取物的分类结果，并且能够预测未知烟草提取物的类别。本研究中OPLS-DA 模型由每个实际烟草提取物构建，3 组样品具有良好的分类。在预测之前，先对该模型进行训练，判断模型的准确度，结果如表2所示，准确度均为100%，识别率高达100%。说明该模型准确度较高，可用于下一步的样本预测［20，26］。为了证明该模型的预测能力，除了用于寻找特征差异物和建立分类模型的64个烟草提取物样品外，又使用19个不同产地的烟草提取物，导入OPLS-DA 模型进行预测，所有不同组预测样本均没有出现分类错误，模型预测结果与实际样本产地结果均一致，准确度为100%。进一步表明构建的OPLS-DA模型具有良好的预测能力，能够对云南、津巴布韦和其他产地烟草提取物进行正确分类，可用于烟草提取物的产地溯源。

表2 OPLS-DA模型预测烟草提取物的分类结果Tab.2 Classification results of tobacco extracts predicted by OPLS-DA model

2.3.3 不同组烟草提取物特征成分比较

变量投影重要性（VIP）可用于筛选对不同烟草提取物有重要影响的关键标记物。如图5所示，51个VIP 值大于1 的挥发性和半挥发性化合物在判别中具有重要作用。对VIP 大于1 的变量进行单因素方差分析共筛选出16个特征挥发性成分，以P＜0.01表示极显著差异的成分，P＜0.05 表示显著差异的成分，其中，在YN、JBBW 和QT 样品中的相对质量分数差异结果见表3。对比YN和JBBW两组烟草提取物，A4（丝氨醇）、A8（一缩二丙二醇）、B1（乳酸乙酯）、B4（γ-丁内酯）和D1（4-环戊烯-1，3-二酮）5个成分具有极显著差异，其中一缩二丙二醇为丙二醇的缩合物，非烟草本身含有的组分；对比YN 和QT样品，A4（丝氨醇）和B2（2-羟基丙基乙酸酯）具有极显著性差异；对比JBBW和QT样品，B1（乳酸乙酯）、F19（3-甲基三十一烷）和K1（2-羟基-5-甲基吡啶）3个成分具有极显著性差异。结合表3中均值排序，丝氨醇、γ-丁内酯和4-环戊烯-1，3-二酮的P值均小于0.01，且对YN 样品具有较好的辨别能力，可作为鉴别YN样品的特征性组分；2-（2-羟基丙氧基）-1-丙醇、乳酸乙酯、间苯二甲酸二（4-辛基）酯和3-甲基三十一烷均对JBBW 样品具有相对较好的辨别能力，其中乳酸乙酯具有极显著差异，可作为鉴别JBBW样品的特征性组分；2-羟基丙基乙酸酯和1-羟基-2-丙基乙酸酯在QT 样品中质量分数均值高，相比于YN 和JBBW 样品均具有显著差异，可作为QT样品的特征性组分。

图5 不同烟草提取物样品特征挥发性和半挥发性成分的VIP图Fig.5 VIP analysis of characteristic volatile and semi-volatile components in different tobacco extract samples

表3 不同烟草提取物样品特征挥发性和半挥发性成分差异比较Tab.3 Comparison of characteristic volatile and semi-volatile components among different tobacco extract samples

3 结论

①通过固相支持液液萃取-GC-MS 方法，结合化学计量学手段，确定了云南、津巴布韦和其他烟草提取物中共125个挥发性和半挥发性成分，其中烟碱的质量分数最高；②PCA和聚类热图分析表明，不同组样品分类不明显，而OPLS-DA对不同组烟草提取物区分效果较好，模型训练和预测的准确度均为100%；③筛选出16个特征挥发性物质，其中，云南、津巴布韦和其他产地烟草提取物中分别筛选出3个、1个和2个可有效表征烟草提取物产地的特征组分。相比于常规采用的感官评价方法，本方法具客观、准确度高的特点，可为烟草提取物的质量鉴别与产地溯源提供方法参考。