老芒麦衰老过程中叶片叶绿素和光合作用变化特征及对养分的响应

2022-02-10张永超梁国玲秦燕刘文辉贾志锋刘勇马祥

草业学报 2022年1期

张永超，梁国玲，秦燕，刘文辉，贾志锋，刘勇，马祥

（青海省畜牧兽医科学院，青海大学，青海西宁 810000）

老芒麦（Elymus sibiricus）是禾本科（Gramineae）披碱草属（Elymus）的模式植物，又名西伯利亚披碱草、垂穗大麦草等［1］。老芒麦在我国主要分布于西北、东北、华北等地区，是青藏高原等地区最重要的饲草之一，也是高寒草甸草原和草甸群落中的优势种和建群种［2］。

植物经过多年的生长，代谢和分子水平突变的积累，逐渐表现出退化症状。衰老是植物发育的重要阶段，常常与退化，凋敝，发病和死亡相关。程序化的衰老是在时间序列上，受到自身发育和环境的影响，由遗传物质严格调控植物体内的激素、信号转导分子、激酶和转录因子的系列转录和表达完成［3］，是植物对环境养分波动的快速响应［4］。老龄化是一个与时间相关的变化过程，它与植物整个生活史中的生长、分化、成熟、衰老和死亡各个阶段相互融合和相互作用［5］。研究表明，植物衰老受到叶绿体的降解，氮含量降低，脂类代谢加快和激素等内部因素［6］和高温、低温、干旱和疾病等外部因素影响［7］。

光合作用是植物积累有机物的重要途径，而光合作用主要由叶绿素参与完成［8］。研究表明叶绿素含量和光合效率成正比［9］。小麦（Triticum aestivum）叶绿素含量随着生育期的推进呈先升后降趋势，花期最大［9］。水稻（Oryza sativa）叶位从高到低，光合系统Ⅱ的最大光化学效率（maximal photochemistry efficiency of PSⅡin the light，Fv/Fm）和实际光化学效率（actual photochemical efficiency of PSⅡin the light，ΦPSⅡ）显著降低，随着叶片的衰老，叶绿素含量下降［10］。在单一生长季中植物叶片通常会随着叶位上升，自下而上进行衰老，但偶尔也会出现逆向衰老现象，旗叶早于倒二叶发生衰老［11］。叶绿素的动态变化和植物叶片光合特征可以对牧草或作物生长、高产管理提供一定的指导和指示作用，可以反映植物的生长和衰老过程。

植物衰老研究往往关注于一个生长季，某一器官（叶片）的衰老，以一年生植物为主［12—14］，多年生较少，且多年生植物研究也多集中于一个生长季中［15—18］。多年生植物整个生活史过程，年际间叶绿素含量和叶片光合特征的变化是否和植物衰老相关，罕见报道。不同树龄油茶（Camellia oleifera）的二年生叶片叶绿素含量要高于一年生［16］。红三叶（Trifolium pratense）衰老叶片中叶绿素、类胡萝卜素和可溶性蛋白含量显著降低［19］。毛竹（Phyllostachys heterocycla）叶片光合效率和叶绿素含量在衰老过程中显著下降［20］。多年生草本植物南荻（Triarrhena lutarioriparia）叶片的衰老等级与叶绿素含量显著负相关［21］。3龄马兰（Kalimerisintegrifolia）净光合速率显著低于1、2龄［18］。

土壤养分匮缺是促进植物衰老的重要影响因素。养分添加，尤其是氮素对延缓叶片衰老、提高叶片光合有效作用时间和效率有明显效果。一年生作物燕麦（Avena sativa）施氮后，其叶面积、叶绿素含量均显著提高，过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性显著增强，叶片衰老减缓［12］。随施氮量的提高，羊草（Leymus chinensis）叶片从上到下叶绿素含量均呈先增加后减小的变化趋势，低氮水平下，羊草上部叶片叶绿素含量显著增加，施氮有效增强羊草叶片过氧化物酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，延缓了羊草衰老［22］。本研究选取青藏高原东北部青海湖湖东地区1～6龄的青牧1号老芒麦作为试验材料，拟揭示1～6龄过程中老芒麦的叶绿素和光合变化特征，同时探讨养分添加对延缓老芒麦衰老的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于青海省海北州西海镇青藏高原多年生牧草种质资源圃，100°59′E、36°54′N，海拔3159 m，属高原大陆性气候，寒冷期长，年平均气温0.9℃，最高气温30.5℃，最低气温—33.8℃，≥10℃年积温634.5℃。光照充足，太阳辐射强。干湿季分明，雨热同季，年平均降水量403.6 mm，无霜期30 d。土壤类型为黑钙土，土壤养分含量为：有机质38.35 g·kg—1、碱解氮2.58 mg·kg—1、速效磷1.36 mg·kg—1、速效钾21.69 mg·kg—1，土壤pH为8.21［6］。

1.2 试验处理

本研究选用青藏高原高寒地区审定登记的青牧1号老芒麦为研究对象。从2015年开始，每年5月中旬进行老芒麦田间种植，播量2.25 g·m—2，行距30 cm，小区面积15 m2（3 m×5 m），种植当年施入底肥尿素10 g·m—2，过磷酸钙50 g·m—2。处理1：2015—2020年青牧1号老芒麦田，种植后不做任何处理。处理2：对2020年6龄老芒麦田进行施肥处理，设置氮肥3个处理（45，60和75 kg·hm—2，N的含量），和磷肥3个处理（60，75和90 kg·hm—2），以不施肥为对照。处理3：以2015年建植的老芒麦田，从2016年开始进行每年连续施肥处理，设置施肥处理16个（表1）。

表1 青牧1号老芒麦田长期施肥处理Table 1 The longer fertilizer treatments of E.sibiricus（kg·hm-2）

1.3 测定项目与方法

在老芒麦开花期（7月底—8月初），采用KONICA MINOLTA，INC公司的SPAD（soil and plant analyzer development）分析仪，从旗叶开始依次向下测定3片叶子的叶绿素相对含量，每个处理随机选取10株健康植株测定。老芒麦叶片光合特性选取旗叶进行测量，随机选取5株健康植株测定，选择天气晴朗早上10：30—11：30进行，采用LI-COR公司的LI-6400XT便携式光合作用测量系统测量。青藏高原地区1龄老芒麦普遍不进行生殖生长，对1龄老芒麦不进行光合测量。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 20.0进行数据分析，采用Microsoft Office Excel 2016整理作图。

2 结果与分析

2.1 老芒麦1～6龄不同部位叶片叶绿素相对含量变化情况及旗叶光合特征

随着老芒麦种植年龄的增加，老芒麦叶片叶绿素相对含量呈现降低的趋势，在1龄和2龄时叶片叶绿素相对含量较高，从3龄开始叶片叶绿素相对含量开始下降，从1龄到6龄，可以划分为3个阶段：1～2龄，3～4龄和5～6龄，这3个阶段间叶绿素相对含量存在显著差异。在6龄时老芒麦叶片出现了逆向衰老现象（图1A）。

图1 青牧1号老芒麦1～6龄田（A），6龄田（B）和连续施肥6龄田（C）的不同部位叶片叶绿素相对含量Fig.1 The leaf chlorophyll content in different part leaf of plant fr om one year s old to six field（A），six years old field（B）and six years old in continuous fertilizer field（C）of E.sibiricus

从2龄到6龄，随着老芒麦年龄增加，旗叶净光合速率持续降低（15.08～6.92μmol·m—2·s—1），4龄和5龄间差异不显著，其他年龄之间存在显著差异（图2A）。老芒麦旗叶胞间二氧化碳浓度随着年龄的增加呈增加趋势，6龄显著高于2，3龄（图2B）。气孔导度从3龄开始显著降低，2龄老芒麦旗叶气孔导度（0.1374μmol·m—2·s—1）显著高于其他高龄老芒麦（图2C）。2龄老芒麦叶片蒸腾速率（4.25 mmol·m—2·s—1）显著高于其他高龄老芒麦，3～6龄之间旗叶蒸腾速率差异不显著（2.54～2.75 mmol·m—2·s—1）（图2D）。

图2 老芒麦田2龄到6龄叶片净光合速率，叶片胞间二氧化碳浓度，叶片气孔导度和叶片蒸腾速率Fig.2 The leaf net photosynthesis rate，the leaf intercellular CO 2 concentration，the leaf stomatal conductance and the leaf transpiration rate from two to six years old of E.sibiricus

2.2 高龄老芒麦（6龄）不同部位叶片叶绿素相对含量对养分添加的响应及旗叶光合特征

施肥普遍提高6龄田老芒麦叶片叶绿素相对含量，且不同部位叶片叶绿素相对含量（33.30%～48.23%）均显著高于不施肥处理（27.05%～30.72%）。第1片（旗叶）叶片在N75处理下叶绿素相对含量与N60处理差异不显著，但显著高于其他施肥和对照处理；P90和P75处理下，旗叶叶绿素相对含量显著高于P60和对照。第2叶片叶绿素相对含量在N75处理下与N60处理差异不显著，但显著高于其他处理，N60处理下显著高于磷肥处理和对照。第3叶片叶绿素相对含量在氮肥处理下都显著高于磷肥处理和对照。在P90和P75处理下，叶片叶绿素相对含量显著高于P60和对照。叶片逆向衰老现象在高氮处理下得到缓解，对照和低磷P60，低氮N45处理下仍然存在叶片逆向衰老现象（图1B）。

6龄老芒麦田氮肥和磷肥添加处理下，除了P60处理与对照差异不显著，其他处理下青牧1号老芒麦叶片净光合速率均显著高于对照。N60处理下叶片净光合速率最高（10.77μmol·m—2·s—1）；当氮肥施入一致时，随着磷素施入量的增加，高磷P90施入处理下，老芒麦叶片净光合速率显著高于中度和低度磷肥处理。P90处理下老芒麦叶片净光合速率除与N45和N75差异不显著以外，氮肥处理均显著高于P60和P75（图3A）。气孔导度在中高氮（N60，N75）（0.1581，0.1582μmol·m—2·s—1）和中高磷（P75，P90）（0.1117，0.1602μmol·m—2·s—1）处理下显著高于对照（0.0573μmol·m—2·s—1）（图3B）。胞间二氧化碳浓度在中高氮处理（N60，N75）和中高磷（P75，P90）处理下显著高于对照（图3C）。N45（3.45 mmol·m—2·s—1）和N60（3.21 mmol·m—2·s—1）处理下叶片蒸腾速率显著高于对照（图3D）。

图3 青牧1号老芒麦6龄田施肥处理对叶片净光合速率、叶片胞间二氧化碳浓度、叶片气孔导度和蒸腾速率的影响Fig.3 The leaf net photosynthesis r ate，the leaf stomatal conductance，the leaf inter cellular CO 2 concentration and the leaf transpiration rate of E.sibiricus cv.Qinghai No.1 in six years old under different fertilizer treatments

2.3 老芒麦长期施肥不同部位叶片叶绿素相对含量对养分添加的响应及旗叶光合特征

在连续施肥6年处理下，老芒麦旗叶叶片叶绿素相对含量在N0P60，N0P75处理下与对照差异不显著，其他氮磷交互施肥处理下，旗叶叶绿素相对含量均显著高于不施肥处理，氮肥的连续施入可有效提高老芒麦旗叶叶绿素相对含量；N75P0（47.94%），N60P60（47.61%）和N45P90（45.58%）处理下，旗叶叶绿素相对含量较高；在低氮N45处理下，旗叶叶绿素相对含量随着磷肥量增加，呈逐渐增加的趋势。在N60这一水平处理，N60P60显著高于其他处理。N75处理水平下，N75P0处理叶绿素相对含量在N75处理下显著高于其他磷肥处理（图1C）。

连续施肥可有效提高6龄老芒麦净光合速率（4.07～12.27μmol·m—2·s—1）。其中N60P0（12.27μmol·m—2·s—1）和N60P75（11.97μmol·m—2·s—1）施肥处理显著提高老芒麦叶片净光合速率。单独磷素的添加可以提高老芒麦叶片净光合速率，尤其是高浓度磷P90显著高于其他单独磷肥处理；单独氮肥处理下，低度和中度氮肥处理（N45，N60）下叶片净光合速率显著高于不施氮肥和高浓度氮肥处理；氮磷配合施入处理下，总体表现出中度氮肥N60结合磷肥可较好地提高老芒麦叶片净光合速率（图4A）。

图4 青牧1号老芒麦连续施肥6龄田中施肥处理对叶片净光合速率，气孔导度，胞间二氧化碳浓度和蒸腾速率的影响Fig.4 The leaf net photosynthesis rate，the leaf stomatal conductance，the leaf intercellular CO 2 concentration and the leaf transpiration r ate of E.sibiricus cv.Qinghai No.1 in six year s old in continuous fertilizer field

长期施肥，6龄老芒麦旗叶气孔导度为0.0447～0.1425μmol·m—2·s—1。N0P90，N45P0，N60P0，N60P60，N60P75施肥处理老芒麦叶片气孔导度分别为0.1425，0.1217，0.1407，0.1335，0.1181μmol·m—2·s—1，普遍高于其他处理。氮磷配合施入总体表现出在低氮和中氮条件下，老芒麦叶片气孔导度随着磷浓度的增加而降低，N45P0处理显著高于N45P60，N45P75和N45P90处理。在N60处理下，N60P0，N60P60和N60P75的气孔导度之间差异不显著，但均显著高于N60P90处理。高氮施入处理下，老芒麦叶片气孔导度随着磷浓度增加，呈现增加的趋势，N75P90处理下气孔导度显著高于N75P0处理（图4B）。

6龄老芒麦旗叶叶片胞间二氧化碳浓度为190.57～282.60μmol·mol—1。N0P90，N45P0，N60P60施肥处理老芒麦叶片胞间二氧化碳浓度分别为277.35，258.28，282.60μmol·mol—1，普遍高于其他处理。中氮N60条件下，P75和P90施入下叶片胞间二氧化碳显著低于N60P0和N60P60。中氮和低磷组合处理下植物叶片胞间二氧化碳浓度最高（图4C）。

6龄老芒麦旗叶叶片蒸腾速率在长期施肥N60P75，N60P0，N0P90，N75P90处理下分别为4.12，4.09，3.70和3.94 mmol·m—2·s—1，普遍高于其他处理，不施肥处理下（1.35 mmol·m—2·s—1）最低。N45施入时，施入磷肥后普遍降低了叶片蒸腾速率。N60和磷肥配合施用使叶片蒸腾速率普遍高于其他施肥处理。高氮处理条件下，老芒麦叶片蒸腾速率随着磷肥浓度的增加而增加，N75P90和N75P75均显著高于对照（图4D）。

3 讨论

植物叶片叶绿素的衰减和含量降低是植物衰老过程中最显著的表型变化之一［23］。根据基因调控假说，植物叶片衰老是基因在特定环境条件下顺序性表达所引起的一系列生理生化代谢的过程。营养失调假说认为叶片衰老是由于植物个体的生殖器官对营养物质的需求量加大，主要的养分生产器官叶片供应能力不足，代谢功能失调而导致衰老［15］。本研究中也发现青牧1号老芒麦在3龄后出现了明显衰老的趋势，主要表现在叶绿素含量的降低，光合效率的减弱，同化物的合成降低，老芒麦整体出现衰老变化。

3.1 叶绿素及光合特征

在多数作物研究中，植物叶片叶绿素含量随着叶位自下而上顺序性降低；光合速率自下而上逐渐增大，且光合速率下降开始的时间以旗叶最晚；蒸腾速率、气孔导度始终维持旗叶＞倒二叶的规律［11］。本研究中，青牧1号老芒麦在生长早中期1～3龄叶绿素含量表现出同样的规律，在后期6龄出现了逆向衰老现象。在小麦生长后期，旗叶叶绿素首先降低，光合速率的衰减滞后于叶绿素的变化［11］，也出现逆向衰老现象。1～3龄的全叶马兰（Kalimeris integrifolia）研究中，到秋季3龄全叶马兰净光合速率和蒸腾速率显著低于1和2龄［18］。在一个生长季节内，多年生豆科红三叶在衰老过程中，叶绿素明显下降［19］，多年生植物南荻随着叶片衰老程度加深，叶绿素含量显著降低［21］。毛竹虽为多年生常绿植物，但其叶片有着明显的老幼更替过程，其叶片的光合效率和叶绿素含量在衰老过程中均显著降低［20］。本研究中老芒麦叶绿素相对含量降低和光合效率的衰减表明1～6龄的老芒麦叶片存在衰老渐进特征。在跨年际的研究中，对6龄，30龄和＞100龄的油茶一年生叶片和二年生叶片进行分析发现，＞100龄的古树二年生叶片叶绿素含量最高，古树中超氧化物歧化酶，过氧化物酶和过氧化氢酶活性强于30龄和6龄［16］。本研究及多数研究中叶绿素含量在衰老过程中降低的结论与此不一致，这可能是木本植物和草本植物生活策略存在差异以及油茶较大的年龄跨度引起的。

3.2 土壤养分添加

氮素是植物生长的必要元素，青藏高原地区老芒麦一年种植，多年利用，除了种植当年养分添加外，以后几乎没有养分添加，多年生老芒麦种子田的退化和土壤养分密切相关。红树（Rhizophora apiculata）叶片在衰老中N，P含量降低［24］。植株缺氮时叶片中叶绿素的合成受阻，从而导致叶部分功能降低［22］。

在以往的研究中，适宜施氮量可提高小麦叶片叶绿素含量［25］，羊草叶片叶绿素含量在施氮后，从上到下呈先增加后减小的变化；低浓度施氮处理显著提高2茬沙地羊草叶片叶绿素含量，同时提高叶片中POD活性和MDA含量显著降低，推迟羊草衰老［22］。李京涛等［26］利用连续28年长期定位施肥试验发现，有机肥和一定量的氮肥配合施用能显著抑制小麦根系细胞膜脂过氧化过程，提高了小麦根系SOD活性、降低了MDA含量，从而延缓植株衰老进程。本研究中养分添加老龄化施肥和连续的定点施肥结果与前期研究一致［22，25—26］，氮磷添加均有效提高6龄老芒麦叶绿素含量和光合速率，连续施肥处理下低氮即可持续保持老芒麦较高的叶绿素相对含量，本研究中磷素对保持老芒麦叶片叶绿素相对含量效果不显著；中度氮肥长期施入，同时配合磷肥添加，可有效维持高龄老芒麦叶片光合效率，可作为老芒麦施肥的参考。多年生牧草种植过程中土壤养分的逐渐流失，可能是导致其衰老的关键因素。

3.3 光合和氮素

叶片衰老在植物养分循环，尤其是氮素的循环中扮演重要的角色［18］，进入衰老程序的叶片器官内氮素调动引起叶绿素含量降低，光合作用减弱。外源氮素的添加有利于维持衰老后期根系的活力，减少衰老叶片氮素输出，可以缓解这一过程［27］。本研究中老芒麦在高龄阶段出现的逆向衰老现象符合衰老过程中养分转移这一规律，同时外援氮素的添加，可以明显缓解逆向衰老。氮素是叶绿素的主要成分，它能促进叶绿体基粒面积增大，叶绿素含量提高，提高Rubisco酶活性，增加胞间CO2浓度。同时氮素能减少细胞内活性氧等物质的产生，提高活性氧清除酶的活性［28］，缓解光合能力的下降，延长和提高了植物叶片的光能功能期和光合效率，放缓了植物整体的衰老进程［29］。