环颈雉骨蛋白风味蛋白酶水解工艺条件的优化

翟学超 王帅

摘要：  选用风味蛋白酶对环颈雉骨蛋白进行水解，在风味蛋白酶的最适温度50 ℃和pH值7.0条件下，以水解度（DH）和氮回收率为指标，优化出风味蛋白酶最适的水解条件：底物浓度为2 g/100 mL，[E]/[S]为2∶100，水解时间4 h。研究表明：在此条件下骨蛋白水解液的水解度和氮收率较为合理，为后续的美拉德反应产生风味物质提供丰富的反应原料，打下良好的基础。

关键词：  风味蛋白酶;  骨蛋白;  水解

中图分类号：   S 865               文献标识码：   A                文章编号：1001 - 9499（2022）01 - 0047 - 03

畜禽骨是一种营养极为丰富的天然资源，其约占胴体的10%～15%，骨本身含有11%～14%的蛋白质，我国是蛋白质资源相对较少的一个国家，因此，高效利用与综合开发骨蛋白质资源具有一定的实际意义[ 1 ]。肉类天然风味物质的生产与制备作为食用香精的一个新兴产业，近年来发展尤为迅速，并由此形成了一个由酶水解、美拉德反应、超临界萃取及喷雾干燥等多种处理方法于一体的天然风味物质生产体系[ 2 - 4 ]。酶解工程技术和美拉德反应是生产天然肉类风味物质的主要方法。酶解能较为高效的利用骨中的蛋白，令其水解成多肽和氨基酸，水解产物更易被人体消化吸收[ 5 ]，还可进一步与糖进行美拉德反应，在最大限度保存了风味物质天然性和营养物质完整性的同时，生产出具有较高风味特征的风味物质。改善了传统香精的耐高温性差、香味驻留时间短、存储条件苛刻、风味不自然等缺点。

本试验通过摸索水解骨汤中骨蛋白时的水解条件，包括底物浓度、酶与底物浓度比、水解时间等，以水解度和氮收率作为标准，筛选最佳的反应条件。

1 试验材料

1. 1 材料与主要试剂

环颈雉骨、风味蛋白酶（Flavourzyme 2×104 U/g）（北京索莱宝科技有限公司）、十二烷基磺酸钠（SDS）（美国Sigma试剂公司）、N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）（上海天虹生物有限公司）、TEMED（北京百奥莱博）、过硫酸铵（APS）（美国Sigma试剂公司）、牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma试剂公司）、甘氨酸（上海蓝源试剂公司）、丙烯酰胺（Acr）（美国Sigma试剂公司）、β-巯基乙醇（美國Amersco试剂公司）、SDS蛋白Marker（美国NEB公司）。

1. 2 仪器与设备

高速离心机TGL-16C、ORP3.0型pH计、JA1003  N-5003N电子天平、精密电子天平AB 204-N、L9 Plus 双光束紫外可见分光光度计、电热恒温水浴锅HH-        M4、精密增力电动搅拌器JJ-1。

2 研究方法

2. 1 珍禽骨蛋白水解液的制备及条件优化

取500 mL骨汤置于烧瓶中，采用蒸馏水稀释和部分浓缩的方法，依次将骨汤的底物浓度调节至2%、3%、4%、5%、6%、7%。用已配制好的1 mol/L的NaOH溶液调节骨汤体系的pH值，使其接近风味蛋白酶的最适pH值（7.0），向其中加入1∶100（[E]/[S]）的风味蛋白酶，并于该酶最适酶解温度（50℃）条件下恒温振荡水解4 h[ 6 ]，在水解反应进行的过程中，根据反应进程向体系内加入1 mol/L的NaOH溶液，使体系pH维持在相对稳定状态，记录耗碱量，并以此通过公示计算水解度。水解完成后沸水浴10 min，以消除残余酶的活性，得珍禽骨蛋白水解液。测定水解物的水解度和氮收率，筛选出最佳的底物浓度，并于该底物浓度条件下，以同样方法在0.5∶100，1∶100，1.5∶100，2∶100，2.5∶100的[E]/[S]中筛选出最佳的[E]/[S]。

2. 2 水解度的测定

水解度计算公式[ 7 ]为：

DH（%） =×100

h=B×Nb×1/α×1/MP

式中：h-单位质量蛋白质中被水解的肽键的量（mmol/g）;htot-单位质量蛋白质中肽键的总量（mmol/g），血蛋白htot-8.8mmol/g;B-水解过程中所消耗的碱量（mL）;Nb -碱液的浓度（mol/L）;MP -水解液中蛋白质的品质（g）;1/α-校正系数（碱性蛋白酶1/α=1.105，中性蛋白酶1/α=1.400）。

2. 3 氮收率的测定

氮收率计算公式为[ 8 ]：

氮收率×100%

式中水解液中和骨汤中蛋白含量均按照国标GB5009.5-2010方法进行的测定，采用凯氏定氮法测定水解液和骨汤中的蛋白含量。

2. 4 硫酸铵标准曲线的绘制

分别准确吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL浓度为100 mg/L的硫酸铵标准溶液于10 mL带塞比色管中，再分别向其中加入4 mL乙酸铵缓冲液和4 mL显色剂，加水补足至刻度，盖紧玻璃塞，震摇1 min，开塞，放入沸水浴中反应15 min，此后取出并将其浸没于冷水中快速降温至室温，于400 nm的波长下测得吸光值。以硫酸铵含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

2. 5 统计分析

试验重复2次，至少一式三份分析。所有数据均采用平均值±S.D，采用数据软件SPSS16.0进行显著性以及相关性分析。显著性水平为P<0. 05。

3 结果与分析

3. 1 不同底物质量浓度对水解度和氮收率的影响

由不同底物浓度对水解度和氮收率的影响（图1）可知：使用风味蛋白酶对骨汤中的蛋白进行水解，随着底物浓度的升高，体系的水解度和氮收率呈降低的趋势。当底物浓度为2 g/100mL时，水解度和氮收率都为最高;随着底物浓度升高，水解度和氮收率逐渐减少，这主要是由于底物浓度较低时，底物与底物之间的空间较大，在同等加酶量的条件下，底物的相对含量较少，风味蛋白酶处于主导地位，可与环颈雉骨蛋白进行充分的接触，因此此时的水解度和氮收率处于较高的水平;底物浓度过大则会阻碍酶和底物的充分接触，此时底物处于主导地位，导致水解度和氮收率下降。

3. 2 不同酶与底物浓度比对水解度和氮收率的影响

由不同酶与底物浓度比对水解度和氮收率的影响（图2）可知：在风味蛋白酶的[E]/[S]由0.5∶100递增至2.5∶100的过程中，水解度和氮收率均出现了增加的趋势。其中水解度的上升趋势较为均衡，当[E]/[S]为2.5∶100时，水解度达到最大。[E]/[S]在0.5∶100～2∶100的范围内时，随着[E]/[S]的继续增大，氮收率的上升速度趋向平缓，在[E]/[S]由2∶100向2.5∶100增加过程中，氮回收率出现拐点。氮收率的上升速度则呈现出前期稳定增加后期逐渐减小的趋势，因此选择[E]/[S]为2∶100作为环颈雉骨蛋白水解的最适加酶量。

3. 3 不同水解时间对美拉德反应中间产物及氨基酸态氮损失率的影响

由不同水解时间对美拉德反应中间产物（A294 nm）和氨基酸态氮损失率的影响（图3）可知：A294 nm在0.5～6 h的水解时间内，总体呈上升趋势。氨基酸态氮损失率在0.5～4 h内的上升速度相对较快，而在4～5 h内逐渐趋于平缓，最终维持在8%左右，几乎不再出现变化。这是因为一定量骨汤中的蛋白被风味蛋白酶水解的时间不同，水解液中的蛋白、短肽、氨基酸等的含量也不尽相同，但骨汤中的蛋白含量是一定的，随着水解时间的延长，水解程度也越发彻底。随着后续美拉德反应的进行，水解液中有限的蛋白、短肽、氨基酸等逐渐被耗尽，反应原料不足，最终导致氨基酸态氮损失率维持在一定极限水平不再变化。综上所述，选取水解时间为0.5～4 h的水解液作为美拉德反应的基液相对较好。

3. 4 不同水解时间水解液中蛋白质及短肽的SDS-PAGE电泳变化

由不同水解时间水解液的SDS-PAGE电泳（图4）可知：未风味蛋白酶水解的原骨汤蛋白大分子肽段显色条带颜色深度明显。但随着水解时间的延长，骨汤蛋白大分子肽段的显色条带逐渐变浅、显色带深度逐渐下移，说明骨汤蛋白分子正逐渐被酶水解。在水解1 h的时候，在代表分子量为27.0 kDa～212 kDa的蛋白质大分子條带消失的同时，会在6.5 kDa～20.0 kDa之间生成新的条带，显色带深度下移，说明随着水解时间的延长，小分子量肽段的数量在增加，平均分子量逐渐减小;但随着水解时间的延长，水解程度进一步提高，体系内的大分子物质进一步减少。当水解时间达到4 h时，泳道内已无明显条带，这意味着风味蛋白酶将珍禽骨蛋白完全水解。

4 结 论

通过使用风味蛋白酶，在酶的最适温度50 ℃和最适pH值7.0条件下，于一定时间内采用不同的底物浓度和[E]/[S]对骨汤进行水解，以水解度和氮收率为参考，并根据实际情况优化选择出最适的水解条件：底物浓度为2 g/100 mL，[E]/[S]为2∶100，水解时间4 h。研究表明：在此条件下环颈雉骨蛋白水解液的水解度和氮收率较为合理，为后续的美拉德反应产生风味物质提供丰富的反应原料，打下良好的基础。

参考文献

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第1作者简介：  翟学超（1981-），  男，  副研究员，  硕士研究生，  主要从事特种经济动物及野生动物标准化研究。

通讯作者：  王帅（1981-），  男，  副研究员，  硕士，  主要从事特种经济动物保育和标准化工作。

收稿日期： 2021 - 01 -  20

（责任编辑：   李 丹）