肠道细菌通过竞争生态位和保护肠道内壁降低小菜蛾对Bt的敏感性

陶新娉,贾元虹,孙 燕,韩顺财,夏晓峰,*

(1.福建农林大学应用生态研究所,闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室,福州 350002;2.福建农林大学,农业农村部闽台作物有害生物综合治理重点实验室,福州 350002;3.福建农林大学,教育部害虫生态防控国际合作联合实验室,福州 350002)

小菜蛾Plutellaxylostella是对十字花科作物具有极强破坏性的世界性害虫之一。全世界平均每年因其损失的经济收益及防治成本高达40亿～50亿美元(Furlongetal.,2013)。近年来，化学杀虫剂无节制、不合理的使用，使小菜蛾对几乎所有用于防治的化学杀虫剂均产生了抗性(Lietal.,2016)，导致小菜蛾的防治愈加困难，寻找好的生物防治方法成为当前小菜蛾防控研究的重点。苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)作为当前国际上使用最广泛、研究最深入的昆虫病原微生物杀虫剂之一，具备无农药残留、无环境污染、对人畜无害等优点，是替代化学杀虫剂用于防治小菜蛾的最佳选择之一(Rohetal.,2007)。然而Bt及Bt转基因作物的大量使用导致小菜蛾产生选择性压力，并不断增强对Bt的抗性(Crickmore,2016;Xiongetal.,2021;Sunetal.,2022)，严重威胁Bt制剂的杀虫效力，影响和制约田间农作物的产量与经济收益。小菜蛾作为Bt防治的主要对象之一，同时又是一类对Bt具有强抗性的昆虫，对其Bt抗性机理的研究不仅有助于开发新型可持续的小菜蛾防控策略，还能为其他害虫的防治提供借鉴，是当前生产实践中亟需解决的问题。

肠道作为一个开放的内环境，含有非常丰富的共生微生物资源，是与摄入外源物质接触的第一场所。肠道微生物充当摄入外源物的代谢媒介，近年来被认为是昆虫的一个重要组织器官。肠道微生物通过与宿主昆虫互作，在宿主的营养供给(Xiaetal.,2017)、生长发育(Habinezaetal.,2019)、代谢物解毒(Berasateguietal.,2017)、病原体防御(Tetreauetal.,2018)和农药抗性(Xiaetal.,2013,2018)等方面发挥重要作用。随着“宿主-肠道微生物互作”研究领域的迅速扩大，越来越多的研究表明肠道微生物与Bt抗性密切相关，且不同肠道微生物介导Bt杀虫活性的效应不同。一方面，一些肠道微生物与Bt存在协同效应，提高宿主对Bt的敏感性，加速寄主的死亡。如在舞毒蛾Lymantriadispar、小红蛱蝶Vanessavardui、烟草天蛾Manducasexta和菜青虫Pierisrapae的研究均表明Bt杀虫活性依赖于肠道细菌的存在(Brodricketal.,2006,2009)；粪肠球菌Enterococcusfaecalis通过Bt毒素造成的肠道上皮伤口进入烟草天蛾血淋巴加速幼虫的死亡，从而提高Bt的杀虫活性(Masonetal.,2011)。另一方面，一些肠道微生物与Bt存在拮抗效应，降低宿主对Bt的敏感性，从而减缓宿主的死亡。目前已有多项关于肠道微生物与Bt拮抗效应机制的报道：如Bt菌株可以在无肠道菌的茶长卷叶蛾Homonamagnanima尸体中生长，但不能在正常饲养(含肠道菌)的幼虫中增殖，表明肠道细菌可以通过直接抑制Bt的增殖提高宿主对Bt的抗性(Takatsuka and Kunimi,2000)；棉铃虫Helicoverpaarmigera肠道细菌分泌的蛋白酶会影响Bt原毒素Cry1Ac的活化从而导致Bt毒性的改变(Visweshwaretal.,2015)；印度谷螟Plodiainterpunctella肠道细菌的丢失会影响宿主的免疫应答，导致宿主酚氧化酶活性降低和血凝素基因的低表达；同时肠道细菌痤疮假单胞菌Propionibacteriumacnes代谢分泌的乳酸、乙酸和丙酸等化合物可能通过降低肠道环境pH值，影响Cry毒素的活化，进而降低宿主对Bt的易感性(Orozco-Floresetal.,2017)。

肠道微生物的重要功能及其介导宿主对Bt的抗性使其成为农业害虫生物防控的新靶标。小菜蛾作为田间最早产生Bt抗性的害虫(Xiaetal.,2014)，已成为研究Bt抗性最主要的模式生物，其肠道微生物与Bt抗性之间的关系值得探讨。我们前期的研究发现肠道微生物介导小菜蛾对化学杀虫剂毒死蜱的抗性，并且肠道微生物与免疫系统之间的互作可能导致小菜蛾对化学杀虫剂抗性的进一步增强(Xiaetal.,2013,2018)。关于小菜蛾对生物农药Bt抗性的研究，目前主要集中在Bt与中肠受体的互作(Gongetal.,2010;Guoetal.,2015;Sunetal.,2022)及Bt抗性突变基因功能验证的研究上(Ayra-Pardoetal.,2015;Guoetal.,2015;Crickmore,2016;Liuetal.,2020)，肠道微生物与宿主Bt抗性之间的互作效应及其相关机理的研究方面鲜有报道。本研究通过分析小菜蛾肠道细菌对Bt杀虫活性的影响，明确肠道细菌对宿主肠道的保护作用，初步阐释肠道细菌影响Bt杀虫活性的作用机制，从不同角度解析小菜蛾肠道细菌介导宿主对Bt抗性的效应，促进小菜蛾抗性机理的研究和综合防治。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与菌株

小菜蛾福州敏感品系(FZss)于2004年采集于福建省福州市郊区(26.08°N,119.28°E)，萝卜苗饲养幼虫，10%蜂蜜水饲喂成虫，饲养条件为：温度25±2℃，相对湿度70%～80%，光周期16L∶8D。小菜蛾饲料敏感品系(SLss)购自河南省济源白云实业有限公司，按照沈金红等(2018)描述的方法利用人工饲料饲养幼虫，10%蜂蜜水饲喂成虫，饲养条件同FZss品系。供试肠道细菌肠杆菌Enterobactersp.IAE5 (EbPXG5)菌株(GenBank登录号:JQ396388) 分离自FZss品系小菜蛾肠道，苏云金芽孢杆菌Bt8010菌株由福建农林大学教育部生物农药与化学生物学重点实验室关雄教授赠送，各菌株均保存于福建农林大学应用生态研究所。

1.2 肠道无菌小菜蛾品系的构建

1.2.1无菌饲料的配制：称取麦胚粉30 g、酵母粉16 g、蔗糖8 g、萝卜籽2.4 g、琼脂4.8 g，倒入500 mL锥形瓶混匀，加入800 μL菜籽油、4滴亚油酸、200 mL ddH2O，玻璃棒搅拌均匀，115℃灭菌30 min。待冷却至60℃，置于超净工作台内加入8 mL无菌维生素混合液，摇晃均匀后，倒入90 mm培养皿内，过夜晾干。

1.2.2肠道无菌小菜蛾品系的饲养与鉴定：用卵卡收集正常饲养条件下的SLss小菜蛾卵，在超净工作台对卵卡进行消毒处理：10% NaClO溶液清洗卵卡，正反面各浸泡30 s，无菌水漂洗3次，每次30 s，超净工作台内吹风晾干。分别将最后漂洗的无菌水以及卵的研磨液(将卵置于RNase-free ddH2O中研磨)涂布LB平板观察有无细菌生长，并且卵研磨液进行16S rDNA扩增。将第3次漂洗卵的无菌水以及卵研磨液涂板，无细菌生长，且16S rDNA扩增无条带视为无菌卵。将无菌卵置于90 mm培养皿内，放入无菌人工饲料，在培养皿中间放置一层卫生纸(灭菌)，以防饲养环境过于潮湿，置于恒温养虫室内饲养。幼虫饲养至3龄，随机取3组，每组5头幼虫，幼虫表面经75%无水乙醇浸泡90 s后，用无菌水漂洗3次，解剖收集肠道内容物于含1 mL RNase-free ddH2O的离心管中，充分震荡混匀后作为模板进行16S rDNA扩增，凝胶电泳结果无条带，视为肠道无菌小菜蛾品系构建成功，以自然饲养的FZss肠道内容物16S rDNA扩增结果作为对照。16S rDNA扩增：利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′)扩增16S rDNA(Galkiewicz and Kellogg,2008)。PCR反应体系(25 μL):模板1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,Phanta Max Super Fidelity DNA Polymernse 0.5 μL,ddH2O 8.5 μL,dNTP Mix 0.5 μL。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸1 min,29轮循环；72℃延伸10 min。

1.3 肠道细菌对小菜蛾Bt敏感性的影响测定

取FZss小菜蛾4龄幼虫10头，解剖收集肠道内容物于含1 mL无菌水的离心管中，充分震荡混匀后备用。取100 μL匀浆接种到100 mL液体LB培养基中，37℃ 180 r/min恒温摇床过夜培养，6 000 r/min 10 min离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体3次后，适量无菌水溶解菌体，测定菌液OD600值，制备肠道总菌群(total gut bacteria)菌液。将前期分离的肠道菌EbPXG5于37℃ 180 r/min过夜培养，小菜蛾生防菌株Bt8010于30℃ 180 r/min恒温摇床培养14 h。培养结束后，按上述步骤收集两种菌的菌体，测量菌液OD600值。配制瓶装无菌饲料，待温度冷却至瓶身触手不烫时，加入菌液，对照加相同体积无菌水；单一菌饲料加1 mL无菌水和1 mL EbPXG5菌液或肠道总菌群菌液或Bt8010菌液，混合菌饲料加1 mL肠道总菌群菌液或EbPXG5菌液和1 mL Bt8010菌液。分别配制终浓度OD600=0.05的肠道总菌群菌液、OD600=0.05的EbPXG5菌液、OD600=0.05的Bt8010菌液、OD600=0.05的Bt8010菌液+OD600=0.05的肠道总菌群菌液、OD600=0.05的Bt8010菌液+OD600=0.05的EbPXG5菌液的人工饲料。饲养无菌小菜蛾幼虫至3龄初期，饥饿4 h，饲喂上述配制好的带菌饲料，以无菌人工饲料为对照，每组3个重复，每个重复20头幼虫，每隔12 h记录一次存活率。

1.4 肠道细菌EbPXG5培养液上清与菌体破碎液对小菜蛾Bt敏感性的影响测定

EbPXG5菌株过夜培养，测定菌液OD600值，6 000 r/min离心10 min，分离菌体与上清，上清10 000 r/min离心10 min，0.22 μm滤膜过滤，收集无菌上清液；菌体用PBS缓冲液清洗3次后，加入适量PBS缓冲液溶解菌体，并加入苯甲基磺酰氟(PSFM)使其终浓度为0.1 mmol/L，超声破碎，收集菌体破碎液。分别配制1盒无菌饲料、1盒含Bt8010终浓度为OD600=0.05的人工饲料，切块称重，每克加入100 μL稀释好的OD600=0.05的EbPXG5菌株的上清液和菌体破碎液。饲养小菜蛾幼虫至3龄初期，饥饿4 h，饲喂配制好的饲料，以饲喂无菌人工饲料为对照，每组3个重复，每个重复20头幼虫，每隔12 h记录一次存活率。

1.5 体外分析肠道细菌EbPXG5对Bt8010的生长抑制作用测定

利用牛津杯抑菌圈法体外测试小菜蛾肠道细菌EbPXG5对Bt8010的生长抑制作用。取EbPXG5菌株于37℃摇床过夜培养，液体LB稀释菌液至OD600=2.0备用；Bt8010菌株30℃培养8～9 h，液体LB稀释Bt8010菌液至OD600=0.05后，取1 mL菌液加入100 mL固体LB中，混匀后倒入90 mm培养皿备用。用镊子夹取无菌牛津杯，将EbPXG5放置在距中心30 mm的含Bt8010菌株的LB平板上，卡那霉素对照放置在平板中间，静置30 min后，分别取200 μL OD600=2.0的EbPXG5菌液和200 μL含50 mg/mL的卡那霉素(kanamycin,Kan)加入牛津杯中，于30℃恒温培养箱中培养12 h，测定抑菌圈大小。

1.6 肠道细菌EbPXG5对Bt8010在小菜蛾肠道中生长繁殖的影响测定

为了能够使用抗生素抗性或者荧光来区分EbPXG5和Bt8010，使用电击转化法，将pET28a(EGFP)质粒转化至EbPXG5感受态细胞中构建重组工程菌pET28a(EGFP)-EbPXG5，取50 μL菌液涂布含50 mg/mL Kan的LB平板，37℃恒温培养箱培养12 h，筛选阳性克隆子。以甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)平板作为选择性培养基来区分Bt8010和EbPXG5菌株(Tallentetal.,2012)。配制方法如下：称取46 g MYP溶于1 L蒸馏水中，分装于500 mL锥形瓶中，121℃ 15 min灭菌，待培养基冷却至50℃左右时，每100 mL加入5 mL 50%卵黄乳和2 mL多粘菌素B(10 000 IU)，混匀，倒入90 mm无菌培养皿备用。含Kan的MYP平板制备：待已加入卵黄乳液和多粘菌素B(10 000 IU)的MYP冷却至触手不烫时，每100 mL加入100 μL 50 mg/mL Kan，混匀倒平板。分别配制终浓度为OD600=0.05的pET28a(EGFP)-EbPXG5菌株、OD600=0.05的Bt8010菌液和OD600=0.05的Bt8010菌液+OD600=0.05的pET28a(EGFP)-EbPXG5菌株菌液的人工饲料。饲养无菌小菜蛾幼虫至3龄初期，饥饿4 h，饲喂上述配制好的带菌饲料，每隔12 h取样，每个处理随机取3组，每组5头幼虫。幼虫表面经75%无水乙醇浸泡90 s 后，用无菌水漂洗3次，解剖收集肠道内容物于含1 mL无菌水的离心管中，充分震荡混匀，稀释至10-1,10-2,10-3,10-4和10-5，各取50 μL涂板，平板培养12 h后拍照，根据平板菌落数量，选择合适的稀释浓度进行菌株单克隆计数。回复Bt8010处理组的小菜蛾幼虫的肠道匀浆液涂布MYP平板，回复pET28a(EGFP)-EbPXG5处理组涂布含Kan的MYP平板，回复Bt8010+ pET28a(EGFP)-EbPXG5处理组同时涂布MYP平板和含Kan的MYP平板。

1.7 肠道细菌EbPXG5对Bt8010在小菜蛾血浆中增殖的影响测定

带菌饲料配制及饲喂处理同1.6节操作，每隔12 h取样，每个处理随机取3组，每组5头幼虫。幼虫表面经75%无水乙醇浸泡90 s后，用无菌水漂洗3次，用解剖镊轻轻撕开表皮，在不损坏肠道的情况下使血淋巴自然流出，用移液枪吸取至含800 μL无菌水的离心管中，混匀，稀释至10-1,10-2,10-3,10-4和10-5，各取50 μL涂板，平板培养12 h后拍照。回复Bt8010处理组的小菜蛾幼虫的血淋巴涂布MYP平板，回复pET28a(EGFP)-EbPXG5处理组涂布含Kan的MYP平板，回复Bt8010+pET28a(EGFP)-EbPXG5处理组同时涂布MYP平板和含Kan的MYP平板，选择合适的稀释浓度进行菌株单克隆计数。

1.8 肠道细菌EbPXG5对小菜蛾肠道的保护作用测定

分别配制含终浓度为OD600=0.05的EbPXG5菌株、OD600=0.05的Bt8010和(OD600=0.05的Bt8010+OD600=0.05的EbPXG5菌株)的人工饲料。饲养无菌小菜蛾幼虫至3龄初期，饥饿4 h后饲喂配制好的带菌饲料24 h，每个处理组中随机选取5头幼虫，经75%无水乙醇浸泡90 s 后，用无菌水漂洗3次，在固定液(2.5%戊二醛)中解剖小菜蛾幼虫中肠，4℃固定过夜，1×PBS缓冲液漂洗3次，每次8 min；于通风橱中用1%锇酸固定2 h，1×PBS缓冲液漂洗3次，每次8 min。依次用50%,70%,80%,90%和95%乙醇梯度脱水，每次10 min，100%乙醇脱水20 min，100%丙酮脱水20 min；通风橱内醋酸异戊酯浸渍30 min后，用CO2临界点干燥仪进行干燥，离子溅射镀膜，使用Hitachi公司生产的SU3500扫描电子显微镜观察并拍照记录。

1.9 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 22.0软件对小菜蛾幼虫存活率进行Duncan氏多重比较(Duncan’s multiple range test)分析，若数据因方差齐性检验无齐性时，使用Kruskal-Wallis检验方法进行分析。小菜蛾肠道和血淋巴中Bt8010和EbPXG5菌株的单克隆数量进行常用对数(lgN)转换后使用独立样本t检验(independent samplest-test)进行分析，其中由于N值不能为0，因此数据分析中将均值≤1的数值统一赋值1后进行转换。

2 结果

2.1 肠道无菌小菜蛾的构建

取卵进行表面消毒后第3次漂洗卵的无菌水以及消毒后的卵的研磨液涂布LB平板检测发现平板中无细菌生长(图1:A)，且卵的研磨液16S rDNA扩增无条带(图1：B)，表明收集的卵为无菌卵。与对照(FZss)相比，由无菌卵饲养至小菜蛾3龄幼虫的肠道内容物经PCR扩增后，凝胶电泳检测无条带(图1：C)，表明肠道无菌小菜蛾品系构建成功。

2.2 肠道细菌对小菜蛾Bt敏感性的影响

与取食无菌饲料的对照相比，取食含肠道总菌群(total gut bacteria)和含单一EbPXG5菌株的饲料对小菜蛾3龄幼虫存活率没有影响(表1)，但取食含Bt8010+EbPXG5和含Bt8010+肠道总菌群饲料的3龄幼虫在24,36,48和60 h 4个检测点的存活率均显著高于取食含单一Bt8010菌株饲料(P<0.05)(表1)，表明肠道细菌延长了感染Bt的小菜蛾3龄幼虫的生存时间。取食含Bt8010+EbPXG5饲料的小菜蛾3龄幼虫在36,60和72 h 3个检测点的存活率分别为90%,25%和18%，分别显著高于取食含Bt8010+肠道总菌群饲料的小菜蛾幼虫同时刻检测点的存活率82%,13%和3%(P<0.05) (表1)，表明回复单一肠道细菌EbPXG5的小菜蛾比回复肠道总菌群的小菜蛾幼虫对Bt的抗性更强。

表1 肠道细菌对小菜蛾3龄幼虫Bt敏感性的影响Table 1 Effects of gut bacteria on the Bt susceptibility of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.3 肠道细菌EbPXG5培养液上清与菌体破碎液对小菜蛾Bt敏感性的影响

取食含EbPXG5菌株上清液和含EbPXG5菌体破碎液饲料的小菜蛾3龄幼虫存活率与取食无菌饲料的对照组相比无显著差异(P>0.05)(表2)，表明EbPXG5菌株上清液和菌体破碎液均不影响小菜蛾幼虫的生存。此外，取食含Bt8010 +EbPXG5菌株上清液和含Bt8010+EbPXG5菌体破碎液饲料的小菜蛾幼虫存活率与取食含Bt8010饲料的小菜蛾幼虫相比无显著差异(P>0.05)(表2)，表明肠道细菌EbPXG5菌株胞外分泌物和胞内物质对小菜蛾Bt抗性没有影响。

表2 肠道细菌EbPXG5培养液上清与菌体破碎液对小菜蛾3龄幼虫Bt敏感性的影响Table 2 Effects of culture supernatant and bacterial lysate solution of the gut bacterium EbPXG5 on the Bt susceptibility of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.4 EbPXG5影响Bt8010在小菜蛾肠道中的增殖

不管是取食含单一EbPXG5饲料的小菜蛾3龄幼虫还是取食含Bt8010+EbPXG5饲料的小菜蛾3龄幼虫，EbPXG5菌株均能在其肠道中定殖，但在48 h内取食两种饲料的小菜蛾3龄幼虫肠道EbPXG5菌株的丰度均没有显著差异(P>0.05)(图2:A)。取食含单一Bt8010饲料的小菜蛾，12 h后Bt8010在小菜蛾肠道内快速增殖，36 h达到高峰(图2:B)，这与Bt8010对小菜蛾的杀虫效果是一致的(表1)。取食含Bt8010+EbPXG5饲料24,36和48 h的小菜蛾3龄幼虫肠道内Bt8010菌落的丰度显著低于取食含单一Bt8010饲料(P<0.01)(图2:B)，表明EbPXG5能够抑制Bt8010在肠道内的生长繁殖。有意思地是，牛津杯抑菌圈试验表明小菜蛾肠道细菌EbPXG5在体外对Bt8010菌株并无抑制作用(图2:C)。

图2 肠道细菌EbPXG5对Bt8010菌株在小菜蛾3龄幼虫肠道内和体外的抑制效应Fig.2 Inhibitory effects of the gut bacterium EbPXG5 on Bt8010 strain in the gut of the 3rd instar larvae of Plutella sylostella and in vitroA:小菜蛾幼虫肠道中EbPXG5的丰度Abundance of EbPXG5 in the gut of P. xylostella larvae;B:小菜蛾幼虫肠道中Bt8010的丰度Abundance of Bt8010 in the gut of P. xylostella larvae;C:EbPXG5对Bt8010的体外抑制效应Inhibitory effect of EbPXG5 on Bt8010 in vitro.Kan:卡那霉素Kanamycin;EbPXG5:肠杆菌EbPXG5 Enterobacter sp.IAE5.图中的星号代表两组间在相应时间点差异显著(**P<0.01;***P<0.001) (t检验)；图3同。Asterisks in the figure indicate significant difference between the two groups at the corresponding time point (**P<0.01;***P<0.001)(t-test).The same for Fig.3.

2.5 EbPXG5影响Bt8010在小菜蛾血淋巴中的丰度

取食含单一EbPXG5饲料的小菜蛾3龄幼虫，24-48 h内幼虫血淋巴中EbPXG5菌株数量很少，且数量保持稳定(图3:A)，表明在正常情况下肠道细菌EbPXG5菌株很少突破肠道屏障进入血淋巴。取食含Bt8010+EbPXG5饲料的小菜蛾，其肠道中EbPXG5菌株的丰度虽然与单一取食EbPXG5没有显著差异(P>0.05)(图2:A)，但在血淋巴中，其36和48 h时的均值均高于单一取食EbPXG5饲料的小菜蛾(图3:A)，表明EbPXG5菌株可随Bt8010从被破坏的肠道进入血淋巴。取食含单一Bt8010饲料的小菜蛾，12 h后幼虫血淋巴中Bt8010菌株数量开始快速增多，36 h后增速放缓，至48 h到达高峰(图3:B)，表明Bt8010菌株可破坏肠道屏障进入血淋巴发挥致病作用。取食含Bt8010+EbPXG5饲料的小菜蛾3龄幼虫血淋巴中Bt8010的丰度显著低于取食含单一Bt8010饲料的(图3:B)，表明肠道细菌EbPXG5菌株的存在抑制了Bt8010的增殖及其进入幼虫血淋巴，进而提高了小菜蛾幼虫的存活率(表1)。

图3 肠道细菌EbPXG5影响Bt8010在小菜蛾3龄幼虫血淋巴中的丰度Fig.3 Gut bacterium EbPXG5 affects the abundance of Bt8010 in the hemolymph of the 3rd instar larvae of Plutella xylostellaA:小菜蛾幼虫血淋巴中EbPXG5的丰度Abundance of EbPXG5 in the hemolymph of P. xylostella larvae;B:小菜蛾幼虫血淋巴中Bt8010的丰度Abundance of Bt8010 in the hemolymph of P. xylostella larvae.

2.6 EbPXG5对小菜蛾肠道的保护作用

扫描电镜观察结果表明，不同细菌处理的小菜蛾3龄幼虫，其肠腔内壁的形态不同。取食无菌饲料的小菜蛾幼虫肠腔内壁形态较为正常(图4:A)；取食含单一EbPXG5饲料的小菜蛾，其幼虫肠腔内壁定殖了大量的EbPXG5菌株，且肠腔内壁较为健康(图4:B)。取食含单一Bt8010饲料24 h时的小菜蛾幼虫，其肠腔内壁具有明显的膨胀、破裂现象，且在破裂处观察到Bt8010菌株的聚集和穿入，表明Bt8010会破坏肠道形成孔洞，同时介导Bt8010及其他细菌穿越肠道屏障进入血淋巴(图4:C)。取食含EbPXG5+Bt8010饲料的小菜蛾幼虫肠腔内壁形态与取食无菌饲料小菜蛾相似，均未出现膨胀、破裂的现象，但取食EbPXG5+Bt8010饲料的小菜蛾肠腔内壁定殖了大量细菌(图4:D)。上述结果表明，肠道细菌EbPXG5能够保护小菜蛾中肠肠腔内壁，减弱Bt8010对其的破坏。

图4 扫描电子显微镜观察的不同细菌处理后小菜蛾3龄幼虫肠道组织Fig.4 Gut tissues of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella treated with different bacteria observed under scanning electron microscopeA:无菌小菜蛾幼虫肠道组织Gut tissues of sterile P. xylostella larvae;B:EbPXG5处理组小菜蛾幼虫肠道组织Gut tissues of P. xylostella larvae treated with EbPXG5;C:Bt8010处理组小菜蛾幼虫肠道组织 Gut tissues of P. xylostella larvae treated with Bt8010;D:EbPXG5+Bt8010处理组小菜蛾肠道组织Gut tissues of P. xylostella larvae treated with EbPXG5+Bt8010.

3 讨论

抗生素处理消除肠道微生物是探讨宿主肠道微生物功能的重要方式，但随着研究的深入，有关抗生素处理所导致的宿主生理变化是由于肠道微生物清除引起的还是抗生素本身作用所造成的争论日益增多。研究发现持续抗生素处理与降低Bt致病性之间存在联系(Visweshwaretal.,2015;Orozco-Floresetal.,2017)。宿主幼虫从人工饲料中摄取的抗生素可以持续到成虫阶段，并且能够在至少1种鳞翅目昆虫中加强对Bt的防御(Sikorowski and Thompson,1985)。另外，抗生素的直接或间接作用如诱导宿主的解毒反应可能会降低或消除Bt孢子的萌发进而降低宿主对Bt的敏感性(Johnston and Crickmore,2009)。本研究为消除抗生素处理对小菜蛾的直接效应和对Bt8010菌株杀虫活性的影响，进行了肠道无菌小菜蛾体系的构建，结果发现卵的第3次漂洗无菌水有淡淡的条带，猜测是ddH2O经高温灭菌后水中残留的少量死亡细菌的DNA经PCR扩增后放大的结果，但卵的研磨液扩增结果无条带，可以证明收集的卵为无菌卵。肠道无菌小菜蛾体系的成功构建，排除了抗生素处理的不利影响，使研究结果更加客观地体现小菜蛾肠道细菌在宿主Bt抗性中的功能。

宿主对Bt的敏感性受到多种因素的影响，包括Bt菌株、寄主种类和环境条件等。近年来，越来越多的研究表明肠道微生物也会影响宿主对Bt的敏感性。据报道，肠道细菌在Bt致病性中扮演着相互矛盾的角色。在舞毒蛾Lymantriadispar中肠中发现Bt对舞毒蛾的杀虫活性必须依赖于肠杆菌Enterobactersp.NAB3的存在(Brodericketal.,2006)。近期的一项研究也发现，小菜蛾中肠细菌能够促进Cry1Ac毒素的杀虫活力，但不是所有细菌都具有这种效果，比如EnterococcusmundtiiPxG1,CarnobacteriummaltaromaticumPxCG2和AcinetobacterguillouiaePxCG3显著提高了Cry1Ac的杀虫活力，但EnterobactercancerogenusPxG2,EnterobacterbugandensisPxG11 以及StaphylococcuswarneriPxCG4则对Cry1Ac毒素的杀虫活力没有影响(Lietal.,2021)。相反地，另外一些研究则发现Bt对宿主的杀虫活性不依赖于肠道细菌，但肠道细菌的存在可以给宿主幼虫提供保护，进而使感染了Bt的幼虫死亡率下降(Johnston and Crickmore,2009;Raymondetal.,2009)。我们的研究结果表明，Bt对小菜蛾的致病性不依赖于肠道细菌，但肠道细菌的存在能够影响小菜蛾对Bt的敏感性，肠杆菌EbPXG5可提高小菜蛾对Bt的抗性。为什么不同研究的结果会出现不一致？其原因可能是由于不同的宿主特异性、肠道菌特异性，以及研究是针对Bt毒素还是Bt菌株等原因造成的。当前随着研究的深入，肠道微生物的功能已经进入株系的水平，即使是同种微生物，其不同株系也有可能表现出完全不同的功能和活性，如不同株系的沙雷氏菌SerratiaY1和SerratiaJ1在中华按蚊Anophelessinensis肠道的定殖对宿主免疫系统的激活作用不同，从而介导宿主对疟原虫Plasmodiumberghei不同的抗性(Baietal.,2019)。这些研究结果为基于肠道微生物的害虫生防策略开发提供了新的理解和思路。

定殖抗性是防止病原体入侵宿主并占据生态位的关键，肠道共生菌通过竞争生态位、竞争营养、接触致死、产生拮抗分子或激活宿主免疫反应等直接或间接机制介导宿主对入侵病原体的定殖抵抗(Jacobsonetal.,2018)。本研究中，体外牛津杯抑菌圈试验发现小菜蛾肠道细菌EbPXG5对Bt8010菌株的生长无抑制作用，且EbPXG5菌株的胞外分泌物和胞内菌体蛋白对小菜蛾的Bt抗性没有影响，但取食含EbPXG5与Bt8010饲料的小菜蛾肠道和血淋巴中Bt8010菌株的数量被显著抑制，推测EbPXG5可能不是通过抑制Bt菌株的生长或产生代谢分泌物抑制Bt等方式直接提高小菜蛾对Bt的抗性，而是可能与Bt8010菌株竞争生态位，其在肠道内的大量定殖挤占了Bt8010菌株的空间，从而降低Bt8010在肠道内的定殖。小菜蛾肠道细菌的定殖抗性，能够限制病原体在宿主体内的定殖与传播，该结论与Shan等(2014)报道的结果不同，其研究表明大部分金龟子甲虫如Holotrichiaoblita,H.parallela和Anomalacorpulenta肠道细菌对Bt具有体外直接抗菌活性，其肠道细菌可能会通过抑制Bt菌株生长的方式直接介导金龟子甲虫对Bt的敏感性；Niu等(2016)的研究结果则与我们的相似，其研究发现秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans在感染条件致病菌后，宿主体内的某些肠道共生菌成为肠道优势微生物区系，线虫肠道共生菌利用竞争生态位的方式抵抗入侵病原细菌在肠道的定殖。值得注意的是，本研究中使用pET28a(EGFP)质粒转化EbPXG5构建重组工程菌pET28a(EGFP)-EbPXG5用于研究EbPXG5在肠道和血淋巴中的分布，原本是希望利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光以及pET28a的卡那霉素抗性的双重标准来准确定位和鉴定EbPXG5。本研究中，可能由于EbPXG5缺乏pET28a(EGFP)载体表达EGFP的转录因子，所以不能表达EGFP蛋白，但却可以表达卡那霉素抗性基因，因此在后期的研究中，我们仅使用了卡那霉素抗性这一特征对EbPXG5进行鉴别。另外一点，我们目前尚不知道pET28a(EGFP)质粒是否会影响EbPXG5的生理生化特性，进而影响其与宿主和Bt8010的互作，从而对实验结果造成偏差，后续研究仍需进一步确认pET28a(EGFP)质粒的引入是否会对EbPXG5的功能产生影响。

扫描电镜观察发现EbPXG5能定殖于小菜蛾肠腔内壁，减弱Bt8010对肠道内壁的破坏；本课题组前期研究发现EbPXG5菌株能够在小菜蛾肠道内定殖，并在肠道上皮形成稳定的生物膜(数据暂未发表)，推测EbPXG5菌株很有可能以其肠腔定殖形成的生物膜作为物理屏障，阻止Bt8010产生的Bt毒素与中肠上皮受体蛋白的结合，进而降低Bt8010在血淋巴中的丰度。切叶蚁Acromyrmexoctospinosus中的研究发现，其体内放线菌(共生菌)的丰度随病原真菌感染的增加而增加，且由放线菌定殖形成的生物膜结构可以防止病原真菌孢子与切叶蚁外骨骼的接触，从而保护宿主免受病原真菌的入侵(Currieetal.,2003)。

昆虫肠道作为一个开放的内环境，含有非常丰富的微生物，经过长期的进化，这些微生物与宿主之间形成了稳定的共生关系。这种稳态的持久存在，意味着宿主体内具有调节共生菌群稳态的机制，以避免肠道微生物不受控制地增殖及对宿主的致病作用。肠道微生物的负荷可诱导宿主的保护性免疫反应以恢复肠道细菌的稳态平衡，确保宿主与肠道微生物的互惠共生(Hapfelmeieretal.,2010)；玉米象SitophiluszeamaisPGRP基因家族中wPGRP基因的表达取决于肠道共生菌的生长，这可能是宿主通过调节免疫相关基因的表达来控制肠道共生菌数量和位置的策略(Anselmeetal.,2006;Haine,2008)。此外，小鼠Musmusculus肠道共生菌能够激活MyD88介导的免疫信号通路，该通路诱导产生的杀菌凝集素(RegIIIγ)可增强宿主对入侵病原菌的抵抗力(Brandletal.,2007)。我们的研究发现EbPXG5的增殖抑制了Bt8010在中肠的丰度，推测EbPXG5的大量增殖很有可能打破其在中肠的生态位平衡进而诱导小菜蛾中肠免疫反应来控制EbPXG5的数量，与此同时，中肠免疫产生的效应分子可能对Bt8010具有抑制作用，从而介导小菜蛾对Bt的抗性。甜菜夜蛾Spodopteraexigua的研究发现，中肠细菌的负荷使甜菜夜蛾处于免疫激活状态，进而提高甜菜夜蛾对Bt的耐受性(Hernández-Martínezetal.,2010)。相反地，Bt可通过抑制免疫相关基因来逃避小菜蛾的免疫防御反应(Lietal.,2018)。我们前期的研究也表明Bt8010会抑制小菜蛾中肠的免疫应答，其中与模式识别受体、Toll和IMD信号通路有关的免疫相关基因如：CTL1,PGRP-SA1,Toll9-1,Toll9-2和Spätzle等被显著抑制(Linetal.,2020)。本研究中EbPXG5是否能通过诱导小菜蛾中肠免疫反应来打破Bt8010对小菜蛾的免疫逃避，从而抑制Bt8010的定殖是一个值得研究的问题，需要后续进一步深入探究。

综上所述，本研究揭示了肠道细菌在介导小菜蛾Bt敏感性方面的重要作用，并以影响宿主Bt抗性的肠道细菌EbPXG5为模型，从不同角度解析了EbPXG5影响小菜蛾Bt敏感性的效应和潜在机制。首先，EbPXG5可能通过产生定殖抗性，一方面减少Bt8010菌株在肠道内的定殖，另一方面以定殖形成的生物膜作为物理屏障，阻断Bt毒素与中肠上皮受体的结合以保护小菜蛾肠道内壁的完整性。其次，肠道细菌EbPXG5可能激活小菜蛾的中肠免疫，而中肠免疫产生的效应分子会抑制Bt8010的增殖。这些潜在作用机制仍有待后续进一步研究，阐明这些机理，不仅能够丰富肠道细菌介导的Bt抗性理论，促进肠道微生物与宿主的互作和共进化研究，同时对未来基于肠道细菌的害虫综合治理也具有重要意义。