家蚕胚胎中胚胎发育因子基因BmEDF G4结构的验证及其结合蛋白的筛选

黄 琼,彭玉玲,冯启理,牛康康

(华南师范大学生命科学学院,昆虫科学与技术研究所,广东省昆虫发育生物学与应用技术重点实验室,广州市昆虫发育应用重点实验室,广州 510631)

DNA是重要的遗传物质，DNA分子能形成一些非B(non-B)结构(van Holde and Zlatanova,1994)，如Z-DNA、三联体(triplex)结构、十字形结构(cruciform)、G-四链体(G-quadruplex)和i-motif等结构(Gellertetal.,1962;Frank-Kamenetskii and Mirkin,1995)。在一些鸟嘌呤(guanine,G)富集的区域会形成一种特殊的四链体结构，被称为G-四链体(G4)结构，该结构被Gellert等(1962)在体外首次发现。G-四链体的结构有很多构型(Collie and Parkinson,2011)，现阶段研究比较多且结构相对稳定的是由3个以上G平面构成的G4结构(Bugaut and Balasubramanian,2008)，这种结构的G4序列通常可用结构式表示：…G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3…(N代表A，T或C；数字表示碱基的数目)。4个G可以通过Hoogsteen氢键连接构成一个G-四分体(G-quartet)，1价阳离子(例如K+,Na+等)可以帮助稳定G-四分体(Parkinsonetal.,2002)。两个或多个G-四分体堆叠形成G4结构。由于G束(G-tracts)方向多样、组成G4的DNA链多样、构成G4的G-四分体平面数不同以及连接各G-四分体的环(loop)不一样，导致G4结构构型的不一样，所以G4结构存在构型和功能的多样性(Yakuetal.,2012;Qiuetal.,2015)。

研究结果显示，基因组中存在大量潜在的G4序列(Rhodes and Lipps,2015;Bedratetal.,2016)，并且倾向于富集在某些功能域，如启动子区、复制起始区、端粒末端等(Rawaletal.,2006;Reedetal.,2006;Maizels and Gray,2013;Bedratetal.,2016)。G4在基因组中的位置和分布上的保守性暗示了该结构在细胞中起着重要的调控功能(Nakkenetal.,2009;Capraetal.,2010)。目前G4的生物学功能主要与DNA复制、基因转录、蛋白质翻译、端粒寿命等细胞过程相关(Bonnaletal.,2003;Bochmanetal.,2012;Valtonetal.,2014;Rhodes and Lipps,2015;Wallgrenetal.,2016;Niuetal.,2019)。几乎所有这些细胞过程都涉及与G4特异性相互作用的蛋白质。G4结合蛋白的鉴定对于研究DNA G4结构的生物学功能至关重要。目前已有多个G4结合蛋白被鉴定出来，它们均与G4结构的形成、解构或功能有关(Arimondoetal.,2000;Mohagheghetal.,2001;Etzionietal.,2005;Londonetal.,2008;Williamsetal.,2017;Niuetal.,2019)。

有研究表明，G4结构在斑马鱼Daniorerio胚胎发育过程中发挥重要的调控功能，当通过反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)干扰的方法抑制G4形成后，斑马鱼的胚胎发育受阻，最终死亡(Davidetal.,2016)。本研究为了阐释G4在家蚕胚胎发育过程中的功能，我们根据生物信息学预测的数据结合实时荧光定量PCR的结果，筛选到家蚕Bombyxmori胚胎发育因子(embryonic development factor,EDF)基因BmEDF可能受到G4结构的调控，而且在家蚕胚胎发育过程中可能发挥重要的调控功能。通过圆二色谱(circular dichroism,CD)和凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)证明BmEDF的启动子区存在G4结构，并且核蛋白BmeIF4H在体外条件下可与BmEDF的G4结构结合，二者可能与家蚕的胚胎发育有一定关系，研究结果可为解析家蚕胚胎发育的DNA高级结构调控机理提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 家蚕材料与主要试剂

实验材料家蚕为P50(大造)品系，由广东省农业科学院蚕业所提供，在温度27℃、相对湿度70%±5%和光周期设定为14L∶10D的恒温培养箱饲养。家蚕 Bm12卵巢细胞株，用含有10%胎牛血清(HYCLONE,澳洲)的Grace (GIBCO，美国)昆虫培养基于27～28℃恒温培养中贴壁培养。反转录试剂盒GoScript Reverse Transcription Mix购自Promega公司;荧光定量试剂盒Eastep qPCR Master Mix Kit购自上海普洛麦格生物产品有限公司;核蛋白提取试剂盒Minute Cytoplasmic and Nuclear Extraction Kit购自Invent公司;BCA蛋白定量试剂盒购自贝博公司;链霉亲和素磁珠购自Thermo公司;化学发光EMSA试剂盒Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit购自Thermo公司;表达载体为pET28a，为实验室保存。大肠杆菌Escherichiacoli感受态DH5α以及BL21(DE3)均购自康体生命公司;质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;蛋白纯化所用的Ni-NTA镍柱购自GE Healthcare公司;无血清培养基Opti-MEM购自美国Invitrogen公司;Fugene HD转染试剂购自Promega公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司;pGL3载体以及内参载体pRL-SV40购自 Promega公司。

1.2 生物信息学分析

利用软件QGRS Mapper(https:∥bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php)预测BmEDF的潜在G4序列。将质谱鉴定得到的BmEDF蛋白质序列与UniProt、家蚕数据库silkDB3.0(https:∥silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)和NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)等蛋白数据库的序列进行比对。BmEDF基因编号BGIBMGA003873为家蚕数据库silkDB3.0登录号。用软件SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)对其结构域进行预测，利用软件Genscript和NLS Mapper进行核定位信号预测，利用软件Compute pI/Mw Tool(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)进行等电点预测。

1.3 G4结构的圆二色谱检验

圆二色谱(CD)是研究DNA高级结构常用的方法之一，根据DNA样品吸收峰所在的位置，可以判断该DNA样品是否含有DNA高级结构(Cogoi and Xodo,2006)。将BmEDF的G4序列送至赛默飞公司合成探针，并在探针5′端用生物素(BIO)标记，得到的带标签的G4寡核苷酸探针按比例稀释至100 mmol/L的工作液浓度，配制退火体系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,5 μmol/L探针,100 mmol/L KCl)，以不加KCl(0 mmol/L)的退火体系作为对照。混合均匀后于95℃加热10 min，置于沸水中缓慢(4 h以上)冷却至室温，促进G4序列形成G4结构。

利用CD法检查G4序列和G4结构。CD实验采用J-815型CD光谱仪(Jasco International,美国)进行。采集的光谱波长范围为220～350 nm，步长为1 nm，响应时间为1 s。CD光谱以在室温下对同一样品的3次扫描平均值的表示，并根据缓冲区对信号的贡献进行基线校正。本实验所用的BmEDF(BGIBMGA003873)启动子区的G4序列为：野生型(WT):5′-TGGTGGGTGGTGGGGAGCGCGGGAGGG GTGCG-3′;突变型(Mut):5′-TGGTGAGTGATGAA GAGCGCGAGAGAGATGCG-3′(下同)。

1.4 G4结构的电泳迁移实验

电泳迁移实验同样可以用于检验DNA高级结构是否形成。使用Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo,上海)进行EMSA实验，配制带生物素标记的野生型和突变型G4寡核苷酸探针退火体系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,100 mmol/L KCl,5 mmol/L DNA探针)，以及野生型G4寡核苷酸探针不加KCl作为对照组退火体系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,5 mmol/L DNA探针)，混合均匀后于95℃加热10 min，置于沸水中缓慢(4 h以上)冷却至室温，促进G4序列形成G4结构，取上述退火探针2 μL稀释50倍。参照EMSA试剂盒说明书配制20 μL反应体系，用4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析样品，冰上90 V进行电泳，溴酚蓝迁移至凝胶2/3处停止电泳，凝胶被印迹在带正电的尼龙膜上(Amersham Biosciences,Boston,美国)，使用化学发光EMSA试剂盒进行显影。

1.5 BmEDF启动子活性实验

将BmEDF启动子区片段连接到pGL3质粒中，同时连接突变G4序列的启动子区片段到pGL3质粒中作为对照。在24孔细胞培养板里植入105/mL的细胞，培养过夜，至细胞密度80%～90%时进行转染。取0.5 μg目的载体以及0.05 μg内参载体pRL-SV40，1.5 μL转染试剂，加入25 μL Opti-MEM培养基中充分混匀，室温静置15～20 min，然后转染Bm12细胞。荧光素酶活性测定参照上海翊圣生物科技有限公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行。上述Bm12细胞转染48 h后，每孔加200 μL裂解液，于4℃摇床轻微震荡5 min，充分裂解细胞，于10 000 r/min离心1 min，取20 μL裂解液100 μL荧光素酶底物混匀，用 Promega Glo Max 发光检测仪测定荧光素酶活性A后，加入100 μL反应终止液，继续测定海参荧光素酶发光值B，A/B的比值即为相对荧光素酶活性(relative luciferase activity,RLA)，同一转染实验重复3次。

1.6 BmEDF,BmeIF4H和BmADDH表达的qRT-PCR检测

根据BmEDF(BGIBMGA003873)，BmeIF4H(GenBank登录号:NM_001044195.1)以及BmADDH(GenBank登录号:XM_038013091.)序列利用Primer Premier 5软件设计引物序列，BmEDF-F:5′-GTTTCGTGATCGACACCGCC-3′;BmEDF-R:5′-GA CGGGTGAAAGGCTGGGTT-3′;BmeIF4H-F:5′-CCC ACCAGACCAGACACTTC-3′;BmeIF4H-R:5′-CCG CCGAATATCGACGAAGA-3′；BmADDH-F:5′- TGGT GGCACTCTGTTAGTCC-3′;BmADDH-R:5′- TGTA CTATTTCAACATTACGCCAC-3′。内参基因为BmRP49，引物序列为:BmRP49-F:5′-CAGGCGGTTCAAGGG TCAATAC-3′;BmRP49-R:5′-TGCTGGGCTCTTTCC ACGA-3′。引物由擎科生物公司合成。取家蚕胚胎发育各时期(即产后0.5,2,3,8,16,24,32,40,48,72,96,120,144,156,168,180,196和216 h)的卵，每个时期取约30粒卵为1组，取3组重复，提取RNA，参照GoScript Reverse Transcription Mix试剂盒说明书进行加样，并按照说明书程序反转录得到cDNA。参照Eastep qPCR Master Mix Kit试剂盒说明书进行加样，混合均匀后按两步法PCR扩增程序进行qRT-PCR检测，3次技术重复，扩增程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40个循环。

1.7 家蚕胚胎核蛋白的提取及浓度测定

取家蚕产卵后第1-9天的卵若干，每天30粒左右，将不同时期的所有卵混合，以PBS缓冲液冲洗两次，参照Minute Cytoplasmic and Nuclear Extraction Kit(Invent,北京)试剂盒说明书进行核蛋白提取。核蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒进行测定。蛋白样品于-80℃保存备用。

1.8 与G4结构结合的家蚕胚胎核蛋白电泳迁移实验

使用Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo,上海)进行EMSA实验，配制带生物素标记的野生型和突变型G4寡核苷酸探针退火体系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,100 mmol/L KCl,5 mmol/L DNA探针)，混合均匀后于95℃加热10 min，置于沸水中缓慢(4 h以上)冷却至室温，促进G4序列形成G4结构，取上述退火探针2 μL稀释50倍。参照EMSA试剂盒说明书配制20 μL反应体系，实验组中加入1.7节提取的家蚕胚胎核蛋白10 μg，于室温下静置反应20 min，对于竞争反应，竞争探针(相同的DNA序列但没有生物素标记)按比例添加到结合反应中。反应结束后，用4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析样品，冰上90 V进行电泳，溴酚蓝迁移至凝胶2/3处停止电泳，凝胶被印迹在带正电的尼龙膜上(Amersham Biosciences,Boston,美国)，使用化学发光EMSA试剂盒进行显影。

按上述实验步骤，配制两块同样4%的聚丙烯酰胺凝胶，制备两份实验所用反应样品，使用的所有试剂所有操作以及孵育温度时间等条件都相同，分别上样至两块胶中，在同样条件下进行凝胶迁移，迁移结束后将其中一块进行后续印迹显影操作，另一块置于0.5×TBE缓冲液中，4℃保存。显影成功后将尼龙膜与凝胶对应，将有滞后条带对应位置的凝胶切下，送至辉骏生物公司(广州)进行蛋白质谱鉴定。由于与G4结构结合的蛋白，应该是存在于细胞核中，所以我们根据质谱鉴定结果优先挑选蛋白分子量在20～40 kD之间的转录因子，含有核定位信号的蛋白，并具有蛋白相互作用结构域的蛋白，或者有研究显示其功能与转录调控等有一定关系的蛋白作为与BmEDFG4结构结合的候选蛋白。

1.9 与G4结构结合的候选蛋白BmeIF4H和BmADDH的基因克隆、重组表达与纯化

为了验证BmeIF4H蛋白与BmADDH蛋白是否可以与BmEDF G4结构结合，取家蚕胚胎发育各时期(即1-9 d)的卵提取RNA，反转录合成cDNA。根据BmeIF4H(GenBank登录号:NM_001044195.1)和BmADDH(GenBank登录号:XM_038013091.1)基因的CDS序列设计和合成引物，BmEIF4H的扩增引物：EIF4H-F:5′-GGATCCGATTTGCAGTGTTCCA TGTTTCT-3′；EIF4H-R:5′-AAGCTTACTCATTCGTT TCCCTTAAGTTCT-3′。BmADDH的扩增引物:ADDH-F:5′-GGATCCATGGCACACAAACATTCGCT TG-3′；ADDH-R:5′-AAGCTTTCACTCGAGATTTATG TAATTCG-3′。以家蚕卵cDNA为模板，PCR扩增得到候选蛋白BmeIF4H和BmADDH基因的开放阅读框。PCR扩增体系(20 μL):cDNA 2 μL,Taq酶0.2 μL,dNTPs 1 μL,10×PCR Buffer 1 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 15 μL。扩增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,34个循环；72℃ 10 min。16℃永久保存。将获得的DNA片段克隆到带His标签的pET-28a(+)表达载体中，构建pET-28a-BmeIF4H和pET-28a-BmADDH重组表达载体。

将pET-28a-BmeIF4H及表达质粒(对照)转化大肠杆菌(BL21)，在含有100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中加入0.2 mmol/L IPTG，于37℃ 220 r/min诱导4 h。离心收集菌体，结合缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl)重悬菌体，混合后放置冰上超声破碎，4℃离心取上清，根据说明书使用Ni-NTA镍柱进行纯化，结合缓冲液配制含咪唑的浓度梯度洗脱液洗脱非特异性结合蛋白，咪唑浓度梯度分别为20 mmol/L(30 mL),50 mmol/L(20 mL),100 mmol/L(20 mL)和400 mmol/L(6 mL)和1 000 mmol/L(6 mL)。纯化蛋白在4℃条件下用缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl)透析过夜去除咪唑。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。纯化蛋白用SDS-PAGE检测。对于BmADDH蛋白的表达和纯化条件与BmeIF4H的相同，但结合缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl,6 mol/L尿素。纯化蛋白在4℃条件下用缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl,尿素) 透析过夜，尿素浓度从6 mol/L到4 mol/L到2 mol/L逐渐递减，以使蛋白复性。

1.10 候选蛋白BmeIF4H和BmADDH与G4结构和G4序列结合的电泳迁移实验验证

候选蛋白BmeIF4H和BmADDH的获取见1.9节，BmeIF4H和BmADDH与G4结构和G4序列结合的电泳迁移实验的实验步骤同1.8节。本实验所用的BmEDF(BGIBMGA003873)启动子区的G4序列为：野生型(WT):5′-TGGTGGGTGGTGGGGA GCGCGGGAGGGGTGCG-3′;突变型(Mut):5′-TG GTGAGTGATGAAGAGCGCGAGAGAGATGCG-3′。

1.11 数据分析

所有数据均采用平均值±标准误表示，两组数据之间的差异显著性用Student氏t检验进行分析，多组数据间的差异显著性采用单因素方差分析及post-hocTurkey氏HSD检验。

2 结果

2.1 BmEDF启动子区的G4序列可形成G4结构

对基因BmEDF的启动子序列进行分析，发现在该基因启动子-47--70 bp位置区间内CG含量高达75%，经QGRS Mapper软件分析在-47--70 bp位置预测到一个G4序列。CD结果显示，该野生型G4序列在没有KCl存在的情况下(图1:A，黑色曲线)最大和最小吸收峰分别在263和240 nm，但波峰波谷不明显。在100 mmol/L KCl存在情况下，野生型最大吸收峰和最小吸收峰分别在265和240 nm处明显增强，波峰波谷明显(图1:A，红色曲线)，这是典型的平行G4结构的CD谱(Carvalhoetal.,2017;del Villar-Guerraetal.,2018)，K+有利于G4结构的形成和稳定。当G4序列突变后(图1:A，蓝色曲线)CD峰图发生了改变，263和240 nm处吸收峰消失，说明突变后序列无法形成G4结构。这一结果说明，BmEDF的G4序列在体外可以形成平行的G4结构。

EMSA结果显示，在未加KCl时，野生型G4高级结构形成很少，主要存在一条单链自由探针(图1:B，泳道1)，在加入KCl时，有助于G4高级结构的形成和稳定，在单链自由探针后方有一明显条带(图1:B,泳道2)，说明其已形成G4结构。当序列突变后，单链探针后方的条带消失不见，(图1:B,泳道3)，说明突变后序列无法形成G4结构。这一结果同样说明，BmEDF基因的G4序列在体外可以形成平行的G4结构。

通过突变G4序列，检测G4对BmEDF基因启动子活性的影响，结果(图1:C)显示，对比野生型G4序列，突变G4序列后，其启动子活性显著下降了大约3/4(P<0.01)，说明BmEDFG4结构的存在对BmEDF转录表达具有正调控的作用。

图1 家蚕BmEDF G4结构的圆二色谱(A)和凝胶迁移实验(B)验证及其对BmEDF启动子活性的影响(C)Fig.1 Validation of the G4 structure of BmEDF of Bombyx mori by circular dichroism (A) and EMSA (B) and its effects on the promoter activity of BmEDF (C)EMSA:凝胶迁移实验Electrophoretic mobility shift assay;WT:野生型Wild-type;Mut:突变型Mutant.图3,5和6同。The same for Figs.3,5 and 6.图中数据为平均值±标准误；柱上双星号表示两组间差异极显著(P<0.01,Student氏t检验)。Data in the figure are mean±SE.Double asterisk above bars indicates extremely significant difference between two groups (P<0.01,Student’s t-test).

2.2 家蚕胚胎发育时期BmEDF基因的表达

qRT-PCR结果(图2)显示，BmEDF基因在家蚕胚胎发育时期的表达量一直较低，但在产卵后120 h时表达量显著升高(P<0.05)。

图2 BmEDF在不同发育阶段家蚕胚胎中的表达量Fig.2 Expression levels of BmEDF in Bombyx mori embryos at different developmental stages图中数据为平均值±标准误；柱上不同小写字母代表差异显著(P<0.05,单因素方差分析,post-hoc Turkey氏HSD检验)。Data in the figure are mean±SE.Different small letters above bars represent significant difference (P<0.05,one-way ANOVA,post-hoc Turkey’s HSD test).

2.3 筛选的与BmEDF基因G4结构结合的蛋白

EMSA实验结果如图3所示，野生型G4序列探针与家蚕胚胎核蛋白孵育明显出现3条迁移滞后的条带，并且加入竞争探针之后，3条结合条带逐渐消失，随着竞争探针浓度增加3条条带在逐渐减弱，100倍竞争探针竞争时，条带几乎消失不见。这一结果说明，这3个条带可能是BmEDF基因的G4与家蚕胚胎核蛋白专一结合的蛋白条带。

图3 EMSA筛选与BmEDF G4结构结合的家蚕胚胎核蛋白Fig.3 EMSA experiments of screening embryonic nuclear protein in Bombyx mori binding with the G4 structure of BmEDF泳道Lanes 1-6:1:不加KCl的野生型探针WT probe not added with KCl;2:加入100 mmol/L KCl的野生型探针WT probe added with 100 mmol/L KCl;3:加入100 mmol/L KCl野生型探针+胚胎核蛋白WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein;4:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+胚胎核蛋白+10×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein+10×cold probe;5:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+胚胎核蛋白+50×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein+50×cold probe;6:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+胚胎核蛋白+100×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCI+embryonic nuclear protein+100×cold probe.

2.4 与BmEDF基因G4结构结合的蛋白质谱鉴定

从图3中的3条蛋白带中共鉴定到29种蛋白，筛选得到的其中的两个候选蛋白BmADDH (GenBank登录号:XM_038013091.1)和BmeIF4H (GenBank登录号:NM_001044195.1)均是细胞核蛋白，具有与DNA和蛋白结合的结构域。BmADDH和BmeIF4H在家蚕胚胎发育过程中的表达情况结果显示，BmADDH和BmeIF4H在BmEDF高表达时期(产卵后120 h时)(图2)之前都有一个较高的表达峰(图4)。这个结果进一步表明BmADDH和BmeIF4H可能是BmEDF基因上游的调控因子。

图4 qRT-PCR检测BmeIF4H (A)和BmADDH (B)在家蚕胚胎发育各时期的表达量Fig.4 Expression levels of BmeIF4H (A) and BmADDH (B) in Bombyx mori embryo at different developmental stages detected by qRT-PCR

2.5 BmeIF4H和BmADDH蛋白与BmEDF G4结构的结合

原核表达获得BmeIF4H和BmADDH重组蛋白(图5:A,B;图6:A,B)。EMSA结果显示，形成G4高级结构的探针在凝胶中比单链DNA探针迁移得慢，在自由单链探针后方有一明显条带，说明其已形成G4结构(图5:C，泳道1)。在加入BmeIF4H蛋白后，G4结构的条带明显减弱，同时在上方出现一条明显的结合条带(图5:C，泳道2)，并且随着蛋白量下降，该条带的结合下降(图5:C，泳道2-4)。在加入竞争探针后，结合条带明显减弱，G4结构的条带则明显增强，并且随着竞争探针浓度的增加，结合的条带逐渐减弱直至消失，G4结构的条带增强至原始强度(图5:C，泳道5-8)。而突变探针在G4结构位置无明显条带，说明突变后不能形成G4高级结构，结合条带也没有出现(图5:C，泳道9)，即BmeIF4H蛋白不与突变序列结合，说明BmeIF4H蛋白与BmEDFG4结构结合，但并不与G4序列结合。加入BmADDH蛋白后，无明显的蛋白-G4结合条带，且G4结构条带并没有明显变化，随着蛋白量的增加，也无结合条带出现，说明BmADDH蛋白可能并不与BmEDFG4结构直接结合(图6:C)。

图5 BmeIF4H蛋白表达(A)和纯化(B)及其与BmEDF G4结合的EMSA分析(C)Fig.5 Expression (A) and purification (B) of BmeIF-4H and EMSA analysis of its binding with the G4 structure of BmEDF (C)M:蛋白标准分子量Protein molecular mass standard;1:未经IPTG诱导Not induced by IPTG;2:总蛋白Total protein;3:上清蛋白 Supernatant protein;4:沉淀蛋白Precipitated protein;5:上清蛋白过柱Supernatant protein through the column;6:结合缓冲液过柱Binding buffer through the column;7-13:分别用20,50,100,400,400,400和1 000 mmol/L咪唑洗脱Elution with 20,50,100,400,400,400 and 1 000 mmol/L imidazole,respectively;14:加入100 mmol/L KCl的野生型探针WT probe added with 100 mmol/L KCl;15:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+138 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+138 μmol/L BmeIF4H;16:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+69 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H;17:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+34.5 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+34.5 μmol/L BmeIF4H;18:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+69 μmol/L BmeIF4H +10×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H+10×cold probe;19:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+69 μmol/L BmeIF4H+50×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +50×cold probe;20:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+69 μmol/L BmeIF4H +100×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +100×cold probe;21:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+69 μmol/L BmeIF4H +200×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +200×cold probe;22:加入100 mmol/L KCl的突变型探针+69 μmol/L BmeIF4H Mut probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H.

图6 BmADDH蛋白表达(A)和纯化(B)及其与BmEDF G4结构结合的EMSA分析(C)Fig.6 Expression (A) and purification (B) of BmADDH and EMSA analysis of its binding with the G4 structure of BmEDFM:蛋白标准分子量Protein molecular mass standard;1:未经IPTG诱导Not induced by IPTG;2,5:总蛋白Total protein;3,6:上清蛋白Supernatant protein;4,7:沉淀蛋白Precipitated protein;8:蛋白过柱Protein through the column;9:结合缓冲液过柱Binding buffer through the column;10-13:分别为用20，50,100和400 mmol/L咪唑洗脱Elution with 20,50,100 and 400 mmol/L imidazole,respectively;14,15:依次用2和0 mol/L尿素进行透析Diaysis with 2 and 0 mol/L urea subsequently;16:用PBS缓冲液进行透析Dialysis with PBS buffer;17:加入100 mmol/L KCl的野生型探针WT probe added with 100 mmol/L KCl;18:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+260 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+260 μmol/L BmADDH;19:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+130 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+130 μmol/L BmADDH;20:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+65 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+65 μmol/L BmADDH;21:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+130 μmol/L BmADDH +10×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +10×cold probe;22:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+130 μmol/L BmADDH +50×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +50×cold probe;23:加入100 mmol/L KCl的野生型探针+130 μmol/L BmADDH +100×竞争探针WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +100×cold probe;24:加入100 mmol/L KCl的突变型探针+130 μmol/L BmADDH Mut probe added with 100 mmol/L KCl+130 μmol/L BmADDH.

3 讨论

本研究发现BmEDF基因启动子区含有潜在的G4序列，在体外可以形成G4结构(图1)。我们前期在家蚕中鉴定到一个特异性G4结合蛋白BmLARK (Niuetal.,2019)，那么BmLARK蛋白是否通过与BmEDF基因的G4结构结合而发挥作用的呢？然而在核蛋白的质谱分析中并没有鉴定到BmLARK，可能原因是多样的：第一，BmEDF的G4可能并不与BmLARK结合；第二，BmLARK蛋白与G4结构结合作用较弱，没有检测到它们的结合；第三，与G4结构相结合并且发挥调控作用的蛋白可能并不是单一的，而是多个蛋白共同与其结合，形成蛋白复合体进而发挥其调控作用；第四，在体内发生结合作用的蛋白，在体外实验过程中，可能因为没有合适的条件因而不结合了。因此本研究通过DNA pull-down和EMSA等方法鉴定与BmEDF启动子G4特异性结合的蛋白，结果显示体外条件下BmeIF4H与BmEDF基因启动子区的G4结构可以结合(图5)。BmeIF4H是翻译起始因子，在蛋白质翻译过程中发挥作用。该蛋白含有RNA识别结构域(RNA recognization motif,RRM)，RRM可以与RNA序列结合，也可以与DNA序列结合(Marisetal.,2005)。在BmLARK中，含有两个RRM，它们是与BmPOUM2的G4结构结合所必需的(Pengetal.,2021)。有研究表明，兔eIF4H在蛋白质翻译合成中能够刺激其他真核启动因子例如eIF4B和eIF4F的体外活性(Richteretal.,1998)。虽然，我们还没有研究证据表明BmeIF4H参与了家蚕的胚胎发育过程，但是由于BmEDF基因在家蚕胚胎中后期上调表达，而BmeIF4H能与BmEDF基因的G4结构结合，因此我们推测BmeIF4H和BmEDF可能参与了家蚕的胚胎发育过程。

本研究鉴定到一个可能与BmEDF基因G4结构结合的蛋白BmeIF4H，两者之间的结合及调控活性还需进一步验证。但这一结果为深入研究G4结构参与基因转录调控和家蚕胚胎发育提供了依据，为G4-蛋白相互作用的生物功能研究提供参考。