小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫天然免疫反应的影响

李而涛,鲁祺晗,张丹凤,孔维捷,安春菊

(中国农业大学植物保护学院昆虫系,北京 100193)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属Spodoptera，具有迁飞能力强、寄主范围广、增殖潜能强等特点，现已成为我国农业生产上的一种常发性重大害虫(石旺鹏,2020;吴孔明,2020;Sunetal.,2021)。目前主要依赖于菊酯类、有机磷类、氨基甲酸盐类等化学药剂对其进行防治，但草地贪夜蛾已对部分化学农药产生了不同程度的耐性或抗性(Bolzanetal.,2019;赵胜园等,2019;Liraetal.,2020)。为减少化学药剂使用剂量以及降低抗药性风险，急需寻找、制订和实施草地贪夜蛾绿色防控技术(吴孔明,2020)。

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematode,EPN)具有专性寄生、杀虫速度快、易于大量扩繁、对环境及非靶标生物无副作用等优点，在草地贪夜蛾的绿色防控中应用潜力巨大(颜珣等,2019)。国内外多项研究均表明包括小卷蛾斯氏线虫SteinernemacarpocapsaeAll和NBAIRS59，长尾斯氏线虫SteinernemalongicaudumX-7，夜蛾斯氏线虫Steinernemafeltiae0663PG以及印度异小杆线虫Heterorhabditisindica1 NBAIIH38等在内的昆虫病原线虫可以致死草地贪夜蛾(Acharyaetal.,2020;梁铭荣等,2020;杨淋凯等,2021;Patiletal.,2022)。昆虫病原线虫一方面通过运动和取食造成昆虫组织机械损伤；另一方面向寄主体内释放携带的共生细菌，细菌迅速大量繁殖并分泌毒素蛋白，最终导致寄主昆虫患败血症死亡(杨秀芬和杨秀文,1998;Dillmanetal.,2012)。但昆虫病原线虫在成功定殖之前需要有效对抗寄主昆虫强大的天然免疫系统，进而建立感染(Castilloetal.,2011;Bangetal.,2015)。

昆虫天然免疫反应分为细胞免疫(cellular immunity)和体液免疫(humoral immunity)，二者互相协作完成对病原物的清除或杀灭(Xiaetal.,2018)。细胞免疫主要由功能多样的血细胞介导，昆虫血细胞会通过改变其形态和数目对细菌、真菌、线虫等外源物进行吞噬(phagocytosis)、结节(nodulation)和包囊(encapsulation)等免疫反应(Shenetal.,2016;Arteaga Blancoetal.,2017;Garrigaetal.,2020)。研究表明亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis血细胞可以吞噬侵入体内的球孢白僵菌Beauveriabassiana或形成结节(Shenetal.,2016)；草地贪夜蛾血细胞会对侵入的大肠杆菌Escherichiacoli发生明显的结节反应(白耀宇和孙佳琦,2020)；大蜡螟Galleriamellonella血细胞可以包囊刚硬全凹线虫Panagrolaimusrigidus(Brivio and Mastore,2018)等。但另一方面，昆虫病原线虫通常会采用免疫逃避或免疫抑制的策略来应对寄主昆虫的免疫反应(Castilloetal.,2011)。在夜蛾斯氏线虫侵染大蜡螟的早期阶段，线虫表皮外膜的脂蛋白可以与大蜡螟血淋巴因子结合并在线虫体表形成一层薄膜，这种薄膜可以逃避寄主血细胞的识别并抑制血细胞的包囊反应(Brivioetal.,2002;Mastore and Brivio,2008)。另外，小卷蛾斯氏线虫也可以抑制大蜡螟血细胞的吞噬活性(Brivioetal.,2018)。

昆虫体液免疫反应主要由脂肪体和分泌的体液蛋白介导，包括由酚氧化酶(phenoloxidase,PO)参与的黑化反应以及由Toll通路(Toll pathway)和Imd通路(immune deficiency pathway)调控的抗菌肽(antibacterial peptide,AMP)生成(初源等,2013;Yangetal.,2021)。例如，喂食家蚕Bombyxmori大肠杆菌6,12和24 h后，酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因PPO1和PPO2的表达显著上调，血淋巴的PO活性也显著升高(杨伟克等,2019)；美国白蛾Hyphantriacunea被粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens侵染后体内抗菌肽基因Attacin-B,Cecropin-A,Gloverin,Lebocin和Diapausin等的转录水平会显著升高(Wangetal.,2021)。而昆虫病原线虫则能抑制或降低寄主昆虫的体液免疫反应。如夜蛾斯氏线虫表皮外膜中的脂类物质能够结合大蜡螟体内的寄主互作蛋白，导致血淋巴中酚氧化酶原激活系统的必需因子浓度降低，从而抑制大蜡螟血淋巴的PO活性(Brivioetal.,2006)。小卷蛾斯氏线虫则是利用自身的分泌物来调节寄主的体液免疫，其分泌物中有一种蛋白酶trypsin-like protease可以显著抑制大蜡螟血淋巴的PO活性(Balasubramanianetal.,2010)。Eliáš等(2020)从嗜菌异小杆线虫Heterorhabditisbacteriophora的分泌物中分离得到一个38 kD的肽段，该肽段可显著抑制大蜡螟血淋巴的PO活性。

昆虫响应细菌、真菌、病毒等病原物的免疫反应及免疫机制已多有研究，但昆虫与昆虫病原线虫之间的免疫互作还鲜有报道，尤其是昆虫病原线虫如何影响草地贪夜蛾的免疫反应更是甚少研究。本研究分离和鉴定了草地贪夜蛾幼虫的血细胞类型；观察了小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsaeAll侵染草地贪夜蛾幼虫后草地贪夜蛾幼虫体内血细胞总数目变化和血细胞对线虫的包囊反应；还明确了小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾血细胞吞噬活性、淋巴液PO活性、抗菌肽基因表达以及抗菌活性的影响。本研究所得结果为揭示昆虫病原线虫与草地贪夜蛾免疫互作的内在机理，改善昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的防治效果提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试昆虫：2020年8月，从云南省德宏傣族景波族自治州芒市田间采集草地贪夜蛾成虫，并在中国农业大学昆虫免疫与生化实验室内建立实验种群。之后长期饲养在温度27℃、相对湿度70%和光周期16L∶8D的人工气候培养箱内。成虫在产卵期间补充5%的蜂蜜水，孵化的幼虫喂食人工饲料Ⅱ(李子园等,2019)。将生长至3龄的幼虫单头饲养在十二孔板内并置于培养箱中，取生长至6龄第1天的幼虫用于实验。

1.1.2供试昆虫病原线虫：小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsaeAll由四川省农业科学院植物保护研究所馈赠。定期用5龄大蜡螟幼虫扩繁线虫，并参考White(1927)方法收集侵染期线虫(infective juveniles,IJs)。用双蒸水清洗侵染期线虫3次后，以浅水层法于(7±1)℃保存线虫(Malanetal.,2011)。

1.1.3供试试剂：Nuclease-free H2O，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)，氯化钠(NaCl)，三异丙基乙磺酰(Tris)，苯硫脲(phenylthiourea,PTU)和盐酸多巴胺，购自索莱宝生物科技有限公司；反转录试剂FastKing RT Kit(with gDNase)购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量PCR所用试剂SYBR FAST Universal qPCR Kit购自北京启迪利泰科技有限公司；Lonza无血清培养基(美国LONZA)；pHrodoTMRed金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusBioparticlesTM偶联物，蛋白胨和酵母提取物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.1.4主要仪器：OLYMPUS倒置显微镜，日本Olympus；Nikon倒置荧光显微镜，日本Nikon；96孔酶标板，美国Corning；96孔细胞培养板，南通健格实验器材有限公司；荧光定量PCR仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；微量注射器Hamilton，汉密尔顿(天津)工业技术有限公司；酶标仪Elx808，美国BioTek。

1.2 血细胞的分离与鉴定

首先用75%乙醇对草地贪夜蛾6龄第1天的幼虫体表进行消毒，接着用无菌昆虫针从第2与第3腹足之间戳破小口，收集20 μL血淋巴于预冷的1.5 mL无菌离心管中。再用预冷的PBS(含1%饱和PTU)稀释10倍，最后用移液枪吸取30 μL稀释后的血淋巴置于双凹载玻片上，用盖玻片封片后在倒置显微镜下进行观察并拍照。

1.3 血细胞总数目测定

对同一批次的草地贪夜蛾6龄第1天幼虫体表进行消毒，然后用微量注射器从幼虫第2与第3腹足之间注入1 μL侵染期线虫悬浮液(用PBS缓冲液稀释至3 IJs/μL)。将注射后的幼虫放入培养箱正常饲养，分别于注射后0,3,6,9,12,15,18,21和24 h收集20 μL血淋巴，再按照1.2节所述的方法取10 μL稀释后的血淋巴转移至血球计数板上，在显微镜下对所有血细胞进行计数。每个处理时间点均设置4个生物学重复，同时以注射1 μL PBS的草地贪夜蛾幼虫作为对照。

1.4 血细胞包囊反应测定

体内实验：取部分新收集的侵染期小卷蛾斯氏线虫置于含有20%甘油的PBS中，并在-20℃冰箱中放置6 h处死线虫(记为“冷处死”)，同时将部分侵染期小卷蛾斯氏线虫置于沸水中加热2 min进行处死(记为“热处死”)，然后将未处理和处理后的线虫用PBS洗涤后均重悬至10 IJs/μL备用。按照1.3节所述的方法分别向草地贪夜蛾幼虫体内注入1 μL未处理、冷处死或热处死的线虫悬浮液，然后置于培养箱正常饲养。分别于注射后0.5和2 h，逐头解剖虫体收集线虫，在倒置显微镜下观察血细胞对线虫的包囊现象并拍照。每个处理设置3个生物学重复。

体外实验：用75%乙醇对5头草地贪夜蛾幼虫体表进行消毒，按照1.2节所述的方法共收集约100 μL血淋巴于预冷的1.5 mL无菌离心管，然后用Lonza无血清培养基(含50 ng/μL四环素)悬浮至3×105cells/mL。取100 μL细胞悬浮液加入到96孔细胞培养板内，25℃静置孵育10 min，然后加入1 μL未处理、冷处死或热处死的小卷蛾斯氏线虫悬浮液(10 IJs/μL)继续孵育，2 h后在倒置显微镜下观察包囊现象并拍照。每个处理设置3个生物学重复。

1.5 血细胞吞噬活性测定

按照1.4节体内实验所述的方法对新收集的侵染期小卷蛾斯氏线虫进行处理并重悬至10 IJs/μL，然后取1 μL未处理、冷处死或热处死的线虫悬浮液注入草地贪夜蛾幼虫体内。1 h后注入5 μL pHrodoTMRed金黄色葡萄球菌BioparticlesTM偶联物(2 mg/mL)。再过2 h，从每头草地贪夜蛾幼虫体内收集20 μL血淋巴并用含1%饱和PTU的Lonza无血清培养基悬浮至3×105cells/mL，然后取100 μL血淋巴细胞悬浮液加入到96孔细胞培养板内，25℃黑暗条件下静置孵育45 min。孵育结束后在倒置荧光显微镜下(TRITC检测通道)观察贴壁血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的情况。吞噬率(%)=吞噬细胞数/总细胞数×100，以每个载玻片中3个视野的平均吞噬率表示细胞的吞噬活性。每个处理设置3个生物学重复，以PBS代替线虫悬浮液作为对照。

1.6 血淋巴PO活性测定

体外实验：按照1.2节所述的方法从每头草地贪夜蛾幼虫体内收集20 μL血淋巴，并用缓冲液(20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH 8.0)稀释5倍。然后取30 μL稀释后的血淋巴与1 μL小卷蛾斯氏线虫悬浮液(3 IJs/μL)在25℃孵育30 min。取1 μL孵育后的上清加至预先放入9 μL上述缓冲液的96孔酶标板中，25℃孵育10 min，然后迅速加入200 μL多巴胺底物(2 mmol/L,溶解于50 mmol/L,pH 6.5的磷酸钠盐缓冲液)，在酶标仪中测量490 nm处的吸光值。以每分钟OD490增加0.001作为一个酶活力单位。每个时间点设置3个生物学重复和2个技术重复，同时以1 μL PBS代替线虫悬浮液作为对照。

体内实验：按照1.3节所述的方法向草地贪夜蛾幼虫体内注射1 μL侵染期小卷蛾斯氏线虫(3 IJs/μL)，分别于注射后0.5,3,6,9,12,15,18和24 h收集10 μL血淋巴于预冷的200 μL无菌离心管中，并用上述缓冲液稀释5倍。然后取1 μL稀释后的血淋巴，按照上述方法测定PO活性。每个处理时间点设置3个生物学重复和2个技术重复，同时以注射1 μL PBS的草地贪夜蛾幼虫作为对照。

1.7 抗菌肽基因表达水平qRT-PCR测定

按照1.3节所述的方法向草地贪夜蛾幼虫体内注射1 μL侵染期小卷蛾斯氏线虫(3 IJs/μL)，注射后12和24 h分别收集草地贪夜蛾幼虫，并参考孙莉等(2019)的方法逐头提取虫体总RNA。用1.2%琼脂糖凝胶和Nanodrop ND-2000分光光度计检测总RNA的质量和浓度后，取2 μg总RNA按照FastKing RT Kit(with gDNase)反转录试剂盒操作说明书合成cDNA第1链。取5 μL合成的cDNA用Nuclease-free H2O稀释10倍后用作qRT-PCR的模板。所用抗菌肽基因特异性引物借助Primer Premier 6.0软件设计(表1)，草地贪夜蛾核糖体蛋白L32基因rpL-32被用作内参基因。根据制造商的说明，使用SYBR FAST Universal qPCR Mix在QuantStudio 1实时荧光定量PCR系统上进行qRT-PCR。反应体系及操作参考Ji等(2022)，采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量(Livak and Schmittgen,2001)。每个处理设置3个生物学重复和3个技术重复，同时以注射1 μL PBS作为对照。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.8 血浆抗菌活性测定

按照1.3节所述的方法向草地贪夜蛾幼虫体内注射1 μL侵染期小卷蛾斯氏线虫(3 IJs/μL)，注射后12和24 h，分别从5头草地贪夜蛾幼虫中收集到约100 μL血淋巴(1个生物学重复)，迅速加入1 μL饱和PTU溶液，接着于4℃ 400 r/min离心5 min。然后将上清(即血浆)转移至1.5 mL无菌离心管中，并在90℃水浴加热10 min，再于10 000 r/min离心10 min，收集离心后的上清并用PBS缓冲液将总蛋白浓度定量至3 mg/mL(该样品称为“抗菌肽粗提液”)。每个处理设置4个生物学重复，同时以注射1 μL PBS作为对照。

上述所得的“抗菌肽粗提液”被用于检测对大肠杆菌和藤黄微球菌Micrococcusluteus的抗菌活性。具体做法如下：分别挑取大肠杆菌和藤黄微球菌单菌落，置于10 mL LB液体培养基中，在37℃摇床中培养至终浓度为1×106个/mL。然后将20 μL上述所得的抗菌肽粗提液分别与80 μL的大肠杆菌或藤黄微球菌混合，再于37℃振荡孵育3 h。孵育结束后用PBS连续稀释至适宜浓度，将稀释后的样品均匀涂布在LB固体培养基上，37℃培养24 h后进行菌落计数，并以菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)表示血浆的抗菌活性。每个处理设置3个技术重复。

1.9 数据分析

草地贪夜蛾幼虫血细胞总数目、PO活性、抗菌肽基因表达水平以及抗菌活性水平在线虫侵染前后之间的差异显著性均采用SPSS 17.0软件(SPSS Inc.,美国)中t检验(t-test)进行分析。细胞吞噬率经反正弦转换后，采用SPSS 17.0中One-way ANOVA进行方差分析，并通过Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。利用Microsoft Excel 2003进行数据统计，通过Adobe Illustrator 2019进行绘图处理。

2 结果

2.1 草地贪夜蛾幼虫血细胞类型

本研究从草地贪夜蛾幼虫的血淋巴中分离得到血细胞，并根据它们在显微镜下的大小和形态进行了分类鉴定。结果如图1所示，幼虫血淋巴中共有5种不同类型的血细胞，被分别命名为原血细胞、粒细胞、类绛色细胞、珠血细胞和浆血细胞。其中，原血细胞在所有观察到的血细胞中体积最小，呈球形，质膜无突起(图1:A)。粒细胞为卵形或椭圆形，质膜粗糙呈颗粒状(图1:B)。类绛色细胞体积较大，近圆形，质膜无外突(图1:C)。珠血细胞为卵形或圆形，含有大型膜泡，质膜呈波浪形或梅花形隆起(图1:D)。浆血细胞的形态多样，观察到有纺锤形(图1:E)、圆形(图1:F)和叶形(图1:G) 3种形态，其中圆形的浆血细胞质膜突起呈散射状(图1:F)。

图1 草地贪夜蛾幼虫的血细胞类型Fig.1 Types of hemocytes in Spodoptera frugiperda larvaeA:原血细胞Prohemocyte;B:粒细胞Granulocyte;C:类绛色细胞Oenocytoide;D:珠血细胞Spherulocyte;E,F,G:分别为纺锤形、圆形和叶形浆血细胞Spindle-shaped,round and foliate plasmatocytes,respectively.

2.2 小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血细胞总数目的影响

外源物入侵后，昆虫血细胞会被招募直接对外源物进行吞噬、集结和包囊等，所以昆虫体内游离的血细胞总数目可能会发生变化(Garrigaetal.,2020)。本研究向草地贪夜蛾幼虫体内注射小卷蛾斯氏侵染期线虫后，在不同时间点对血细胞的总数目进行了计数。从图2可以看出，在注射后0-24 h内，注射PBS的草地贪夜蛾对照组幼虫体内血细胞总数目基本维持在6×106cells/mL左右，但注射小卷蛾斯氏线虫的处理组幼虫体内血细胞总数目随处理时间增加呈“下降-升高-下降”的变化趋势。注射线虫6 h内，草地贪夜蛾幼虫体内的血细胞总数目从6.5×106cells/mL降至4.2×106cells/mL，但与对照相比差异不显著(t6=1.32,P>0.05)。此后血细胞数目开始增加，在注射线虫后9 h达到9.7×106cells/mL；然后又开始下降，注射后12 h血细胞浓度为8.0×106cells/mL，这两个时间点的处理组血细胞总数目都显著高于对照组(9 h:t6=3.96,P<0.01;12 h:t6=2.67,P<0.05)。注射线虫12 h以后直到停止取样的24 h，注射了线虫的草地贪夜蛾幼虫体内的血细胞总数目呈下降趋势，但与对照相比无显著差异(t6<1.17,P>0.05)。

图2 小卷蛾斯氏线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫血细胞总数目变化Fig.2 Changes in the total number of hemocytes in Spodoptera frugiperda larvae after infection by Steinernema carpocapsae All图中数据为平均值±标准误；星号和双星号分别表示相同注射时间下两组间存在显著差异(P<0.05)和极显著差异(P<0.01)，未作任何标注表示该时间点两组间不存在显著差异(P>0.05)(t检验)。Data in the figure are presented as mean±SE.The asterisk and double asterisk indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01),respectively,between two groups at the same injection time,while no labeling means no significant difference between two groups at this time point (P>0.05)(t-test).图5-7同。The same for Figs.5-7.

2.3 草地贪夜蛾幼虫血细胞对小卷蛾斯氏线虫的包囊反应

为明确草地贪夜蛾幼虫能否对小卷蛾斯氏线虫进行包囊，本研究首先对小卷蛾斯氏线虫进行了不同处理：将一部分侵染期线虫冷冻处死，此时线虫不能再在草地贪夜蛾幼虫体内繁殖；将另一部分线虫加热处死，此时线虫不仅不能在草地贪夜蛾幼虫体内繁殖，其体表蛋白也因加热而变性。当不同处理的小卷蛾斯氏线虫被注入草地贪夜蛾体内后，0.5 h内均未观察到被血细胞包囊的线虫。注入未处理和冷处死的小卷蛾斯氏线虫后2 h，血细胞依旧均匀分布，没有对线虫进行包囊；但注入热处死致死的线虫后2 h，观察到血细胞成团聚集在线虫表面，对其进行了明显的包囊(图3)。另外，我们还将不同处理的小卷蛾斯氏线虫与分离的草地贪夜蛾血细胞在体外进行了孵育。结果显示，孵育2 h后，未处理线虫和冷处死线虫均未被血细胞包囊，但热处死后的线虫体表出现了明显的血细胞聚集，几乎包裹住了整条线虫(图3)。

图3 草地贪夜蛾幼虫血细胞对小卷蛾斯氏线虫的包囊Fig.3 Encapsulation of Steinernema carpocapsae All by hemocytes of Spodoptera frugiperda larvae冷处死组中，将侵染期小卷蛾斯氏线虫置于含有20%甘油的PBS中，并在-20℃冰箱中放置6 h处死线虫；热处死组中，将侵染期小卷蛾斯氏线虫置于沸水中加热2 min进行处死。图4同。In the cold-killed group,the nematodes of S.carpocapsae All at the infective stage were placed in PBS containing 20% glycerol,and then in refrigerator at -20℃ for 6 h,and in the heat-killed group,the nematodes of S.carpocapsae All at the infective stage were heated to kill in boiling water for 2 min.The same for Fig.4.红色箭头表示聚集的血细胞。Red arrows indicate the clustered hemocytes.

2.4 小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血细胞吞噬活性的影响

为了检测小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血细胞吞噬活性的影响，本研究将不同处理的小卷蛾斯氏线虫注入草地贪夜蛾幼虫体内后，再注入荧光探针标记的金黄色葡萄球菌，最后观察幼虫血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的情况。荧光偶联物标记的金黄色葡萄球菌游离在血淋巴(其pH值接近中性)时不会发出荧光，但被血细胞吞噬后会因为所在环境的pH值从中性变为了酸性会发出红色荧光。因此，视野中红色荧光比例越高意味着血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性越强。结果显示，注入PBS的对照组中约有75%的血细胞吞噬了荧光标记的金黄色葡萄球菌(图4:E)。然而，当注入未处理的小卷蛾斯氏线虫后，观察到仅约21%的血细胞对金黄色葡萄球菌进行了吞噬，吞噬率显著低于对照组(P<0.05)，红色荧光信号也相应地明显减弱(图4:F和K)。当注入冷处死和热处死的小卷蛾斯氏线虫后，血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬效果与对照组相比无显著差异(P>0.05)(图4)。

图4 小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血细胞吞噬活性的影响Fig.4 Effects of Steinernema carpocapsae All infection on the phagocytic activity in the hemocytes of Spodoptera frugiperda larvaeA-D,I:血细胞在明场下的图片，白色虚线方框示意了血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬，其中红色箭头指示的是吞噬了金黄色葡萄球菌的血细胞，绿色箭头指示的是未吞噬金黄色葡萄球菌的血细胞Images of hemocytes under bright field,the boxes with white dashed lines indicating the phagocytosis of Staphylococcus aureus by hemocytes,with red arrows indicating the hemocytes containing phagocytosed S. aureus and green arrows showing the hemocytes without phagocytosed S. aureus;E-H,J:血细胞在620 nm荧光下的照片Images of hemocytes under 620 nm fluorescence field;I,J:分别为图B和F中白色虚线方框的放大Amplification of boxes with white dashed lines in Figs.B and F,respectively;K:血细胞吞噬率Rate of hemocyte phagocytosis.图K数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示不同处理之间在0.05水平下差异显著(Duncan氏多重比较)。Data in Fig.K are presented as mean±SE.Different letters above bars indicate significant differences at the 0.05 level (Duncan’s multiple range test).

2.5 小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血淋巴PO活性的影响

检测小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血淋巴PO活性的影响，本研究首先将收集的草地贪夜蛾幼虫血淋巴与小卷蛾斯氏线虫在体外进行孵育，0.5 h后测定样品的PO活性。结果如图5所示，与对照(PBS)比，血淋巴与线虫体外孵育后，其PO活性显著降低(t4=2.65,P<0.05)。然后，将小卷蛾斯氏线虫注入草地贪夜蛾幼虫体内，并于不同时间点直接收集血淋巴测定其PO活性。结果显示，在注射线虫后的0.5-24 h内，血淋巴PO活性总体呈现“下降-升高-下降”的变化趋势。其中，注射线虫后0.5 h时血淋巴PO活性显著低于对照(t4=3.01,P<0.05)；注射后3和6 h时血淋巴PO活性恢复到对照水平；注射后9和12 h时血淋巴PO活性又显著高于对照(9 h:t4=3.50,P<0.05;12 h:t4=3.31,P<0.05)；注射后15 h时血淋巴PO活性开始降低，但与对照组之间无显著差异(t4=2.07,P>0.05)。

图5 小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫血淋巴酚氧化酶活性的影响Fig.5 Effects of Steinernema carpocapsae All infection on the phenotoxidase (PO) activity in the hemolymph of Spodoptera frugiperda larvae

2.6 小卷蛾斯氏线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫体内抗菌肽基因表达水平的变化

为了调查小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫体内抗菌肽基因表达的影响，本研究在向草地贪夜蛾幼虫体内注入小卷蛾斯氏线虫后12和24 h时，用qRT-PCR检测了几种抗菌肽基因的相对表达量。如图6所示，注射线虫后12 h时，所检测的抗菌肽基因Attacin-A2,Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin,Gloverin-3和Lebocin-2的表达水平均显著高于对照组的(Attacin-A2:t4=3.44,P<0.01;Attacin-B1:t4=3.79,P<0.05;Cecropin-B3:t4=2.58,P<0.05;Cecropin-D:t4=7.26,P<0.05;Gallerimycin:t4=10.05,P<0.05;Gloverin-3:t4=4.21,P<0.05;Lebocin-2:t4=4.68,P<0.05)。但注射线虫后24 h时，Attacin-A2和Gloverin-3的表达水平反而显著低于注射PBS的对照组的(Attacin-A2:t4=3.63,P<0.05;Gloverin-3:t4=3.98,P<0.05)，其他抗菌肽基因Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin和Lebocin-2的表达水平则与对照组相比无显著差异(Attacin-B1:t4=0.03,P>0.05;Cecropin-B3:t4=0.87,P>0.05;Cecropin-D:t4=2.48,P>0.05;Gallerimycin:t4=2.41,P>0.01;Lebocin-2:t4=2.72,P>0.05)。总体而言，注射小卷蛾斯氏线虫后12 h，草地贪夜蛾体内抗菌肽基因的表达被显著诱导，但随着注射时间的延长，到24 h时这些抗菌肽基因表达水平又恢复到对照水平，甚至低于对照水平(图6)。

图6 小卷蛾斯氏线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫体内抗菌肽基因表达水平变化Fig.6 Changes in the expression levels of antimicrobial peptide genes in Spodoptera frugiperda larvae after infection by Steinernema carpocapsae All

2.7 小卷蛾斯氏线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫血浆抗菌活性的变化

本研究除了检测小卷蛾斯氏线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫体内抗菌肽基因的表达水平，还测定了草地贪夜蛾幼虫血浆对大肠杆菌和藤黄微球菌的抗菌活性。结果表明，注射小卷蛾斯氏线虫后12 h时，幼虫血浆对大肠杆菌和藤黄微球菌的杀菌活性均显著高于注射PBS的对照，存活细菌数显著低于对照组(大肠杆菌:t6=7.12,P<0.01;藤黄微球菌:t6=10.36,P<0.01)。但时间延长至24 h，被线虫侵染的草地贪夜蛾幼虫血浆对大肠杆菌和藤黄微球菌的杀菌活性水平与对照组之间无显著差异(大肠杆菌:t6=0.93,P>0.05;藤黄微球菌:t6=0.72,P>0.05)(图7)。

图7 小卷蛾斯氏线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫血浆抗菌活性的变化Fig.7 Changes in the antibacterial activity of plasma from Spodoptera frugiperda larvae after infection by Steinernema carpocapsae AllCFU:菌落形成单位Colony-forming unit.

3 讨论

昆虫为了能够维持自身正常的生长、发育和繁殖，会借助体内发达的天然免疫系统来抵御来自生存环境中的细菌、真菌、病毒等病原物的侵染(Lemaitre and Hoffmann,2007;Xiaetal.,2018)。而昆虫病原线虫等天敌则会逃避或破坏宿主昆虫的天然免疫系统进而致死昆虫(Castilloetal.,2011)。昆虫病原线虫作为防治草地贪夜蛾的一种潜在生防资源，二者之间势必也存在着此消彼长的免疫互作关系。本研究选择了小卷蛾斯氏线虫来侵染草地贪夜蛾，调查了线虫侵染对草地贪夜蛾血细胞总数目、包囊反应、吞噬活性、PO活性以及抗菌肽表达等方面的影响。

昆虫血细胞来源于中胚层时期衍生的干细胞，漂浮于开放式血腔或附着于组织和器官，在昆虫的新陈代谢、变态发育和天然免疫中起着至关重要的作用(Zhangetal.,2018)。目前在昆虫中共鉴定到7种血细胞类型，分别为原血细胞、浆血细胞、粒细胞、类绛色细胞、珠血细胞、凝血细胞和脂肪细胞(Eleftherianosetal.,2021)。鳞翅目昆虫的血细胞主要包括前5种，且浆血细胞和粒细胞在血淋巴中占比较高(Majumderetal.,2017)。倪若尧等(2018)在光学相差显微镜下观察到小金蝠蛾Thitarodesxiaojinensis幼虫血细胞由粒细胞、浆细胞、珠血细胞和类绛色细胞4种组成。孙涛等(2021)采用Wright-Giemsa染色法从阿尔泰蝠蛾Hepialusaltaicola幼虫中分离鉴定到原血细胞、浆血细胞、粒细胞、类绛色细胞、珠血细胞和囊血细胞6种血细胞。本研究从草地贪夜蛾幼虫中共分离鉴定到原血细胞、粒细胞、类绛色细胞、珠血细胞和浆血细胞5种血细胞(图1)，这为进一步研究血细胞介导的细胞免疫反应奠定了基础。

病原物入侵昆虫后，可能会引起昆虫血细胞总数目的波动变化。已有研究发现二化螟Chilosuppressalis感染球孢白僵菌BBLN2,BBRR1,BBAL4或BBLN1后，总血细胞和分化血细胞数目在注射后3和6 h迅速增加，12和24 h逐渐减少(Shahriarietal.,2021)。本研究中草地贪夜蛾幼虫被小卷蛾斯氏线虫侵染后，体内血细胞总数目随处理时间增加总体呈“下降-升高-下降”的变化趋势(图2)。一个可能的解释是：在线虫侵染早期(例如侵染后6 h内)，草地贪夜蛾血淋巴中游离的血细胞向受损的角质层或个别线虫表面聚集导致数目下降；中期造血器官或组织补充血细胞用于提高自身免疫能力，故线虫侵染后9和12 h血细胞数目显著增加；到后期(例如12 h以后)线虫及其共生细菌产生的毒素破坏了血细胞结构致使数目再次下降(Satyavathietal.,2014;李蕾等,2020;常豆豆等,2022)。

昆虫血细胞可对包括昆虫病原线虫在内的外源物进行包囊和吞噬等反应(Arteaga Blancoetal.,2017;Garrigaetal.,2020)。对于个体较大的昆虫病原线虫，血细胞会粘附并聚集在其体表形成一个“鞘”将线虫紧紧包裹在内部，与此同时黑色素逐渐沉积在“鞘”表面，共同导致线虫死亡(Dziedziechetal.,2020)。已有研究表明水椰八角铁甲Octodontanipae血细胞不能包囊小卷蛾斯氏线虫，但能包囊热处死过的小卷蛾斯氏线虫表皮(Sandaetal.,2018)。日本斑翅果蝇Drosophilasuzukii血细胞可以包囊用磷脂酶处理过的小卷蛾斯氏线虫B14(Garrigaetal.,2020)。本研究中体内体外实验结果也表明草地贪夜蛾幼虫血细胞不能包囊活的以及冷处死的小卷蛾斯氏线虫，但可以包囊热处死致死的线虫(图3)。推测其原因可能是：小卷蛾斯氏线虫表皮的外膜蛋白可以逃避草地贪夜蛾幼虫血细胞的识别并避免被包囊，但当高温破坏表皮外膜蛋白结构后，线虫表皮的保护作用失效，所以热处死的线虫能被血细胞识别并被包囊。但值得注意的是，只有未经任何处理的小卷蛾斯氏线虫可显著抑制草地贪夜蛾幼虫血细胞的吞噬活性，冷或热处死的线虫对草地贪夜蛾血细胞的吞噬活性均无影响(图4)。这暗示着小卷蛾斯氏线虫的表皮蛋白可能会影响草地贪夜蛾对线虫的包囊，但不会影响草地贪夜蛾血细胞本身的吞噬活性。究其原因可能是只有活线虫体表会产生分泌物，而分泌物中含有某些蛋白酶、蛋白酶抑制剂、毒素相关蛋白等因子能抑制血细胞的吞噬活性(Luetal.,2017;Changetal.,2019)。具体原因还需要进一步的实验来验证。

当外源物入侵后，昆虫除了开启细胞免疫反应外，也会启动自身的体液免疫系统来试图进行防御。其中，黑化反应是一种重要的体液免疫反应类型，在黑化反应中昆虫的酚氧化酶原会被激活导致血淋巴PO活性的增强(Lietal.,2015;Wang QRetal.,2022)。有研究表明在小卷蛾斯氏线虫侵入红棕象甲Rhynchophorusferrugineus的0.5 h内，红棕象甲血淋巴的PO活性显著降低(Mastoreetal.,2015)。嗜菌异小杆线虫H06和小卷蛾斯氏线虫对水椰八角铁甲的酚氧化酶原激活系统均具有很强的抑制作用(Sandaetal.,2022)。在本研究中，小卷蛾斯氏线虫在侵入的0.5 h内也是显著抑制了草地贪夜蛾幼虫血淋巴的PO活性，与上述研究结果一致。但线虫侵入后9和12 h，血淋巴PO活性又显著升高，之后开始逐渐下降(图5)。这可能是因为9和12 h时线虫以及释放的共生细菌数目都还较少，反而能激活草地贪夜蛾的免疫系统引起PO活性升高；随着线虫及共生细菌释放的各种毒性因子的逐渐积累，草地贪夜蛾的免疫器官或组织受到损伤，导致PO活性逐渐降低。

除黑化反应外，昆虫体液免疫反应的另一个重要类型是抗菌肽的产生(Yangetal.,2021;Longetal.,2022)。当昆虫感染病原细菌、真菌等外源物后，抗菌肽基因会被诱导表达，进一步分泌到血淋巴中导致昆虫血淋巴的杀菌活性大大提高。例如，小卷蛾斯氏线虫侵入水椰八角铁甲后8,16和24 h，寄主体内抗菌肽基因Attacin-C1,Attacin-C2,Attacin-C3以及Defensin-2B的表达水平均显著升高(Sandaetal.,2018)。草地贪夜蛾感染莱氏绿僵菌Metarhiziumrileyi后48 h，其血浆可以显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长(Wang JLetal.,2022)。本研究向草地贪夜蛾幼虫注射小卷蛾斯氏线虫后12 h，抗菌肽基因Attacin-A2,Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin,Gloverin-3以及Lebocin-2均被显著诱导，但注射线虫后24 h这些抗菌肽基因的表达水平又恢复到对照甚至低于对照水平(图6)。与此同时，草地贪夜蛾幼虫血浆对大肠杆菌和藤黄微球菌的杀菌活性也是12 h时显著上升，24 h时与对照无显著差异(图7)。推测小卷蛾斯氏线虫侵入后12 h，线虫以及释放的少量共生细菌激活了草地贪夜蛾体内可以诱导抗菌肽产生的Toll或Imd信号通路，进而引起了抗菌肽基因的显著表达和血浆抗菌活性的升高；线虫侵入后24 h，线虫和共生细菌的数量已经达到一定规模，草地贪夜蛾的免疫系统被破坏，导致抗菌肽的转录和血浆的抗菌活性都出现下降。

综上所述，小卷蛾斯氏线虫在侵入早期，通过抑制草地贪夜蛾幼虫的包囊和吞噬能力以及血淋巴的PO活性来建立感染；随后草地贪夜蛾通过提高自身的血淋巴PO活性、抗菌肽基因表达水平以及抗菌活性水平来试图抵御线虫的侵染；后期随着线虫的成功定殖，草地贪夜蛾的免疫系统被抑制或破坏，导致免疫活性降低。本研究仅从免疫学的角度初步解析了小卷蛾斯氏线虫与草地贪夜蛾互作关系，为改善昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的生防效果提供了理论依据，具体的免疫互作机制还有待于进一步研究。小卷蛾斯氏线虫携带的共生细菌在线虫与草地贪夜蛾免疫互作中所扮演的角色也有待于进一步明确。