果蝇胰岛素样肽8(Dilp8)的功能及作用机制

南 楠,闫志鹏,张亚如,秦国华,桑 楠

(山西大学环境与资源学院,太原 030006)

果蝇DrosophilaDilp8于2012年被Garelli等和Colombani等发现，Garelli等(2012)通过建立引起发育延迟的成虫盘肿瘤模型，并将其与正常果蝇对比，筛选出了潜在的可以协调发育时间的分泌因子CG14059；Colombani等(2012)通过使用UAS-Gal4系统驱动成虫盘中Rpl和avl基因的RNAi引起幼虫发育延迟，之后再使用大量的RNAi品系筛选出敲低表达后对幼虫发育延迟有拯救作用的基因。由于被筛选出来的基因产物具有胰岛素-松弛素肽家族保守的6-半胱氨酸(6-cysteine)基序，所以将其蛋白命名为果蝇胰岛素样肽8(Drosophilainsulin-like peptide 8,Dilp8)。他们同时将这一发现发表于《Science》杂志上，由此开启了人们对于果蝇中Dilp8的探索。自Dilp8被发现的10年以来，有30余篇文献是关于其的研究，其中62.16%探索了Dilp8的功能和作用机制，16.22%是关于其受体富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体3(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 3,Lgr3)的发现和功能，另外16.22%是综述类文章，剩余的5.41%在研究其他内容时提到了Dilp8。其中6篇综述类文章中，Hariharan(2012)阐述了果蝇的生长过程，并对Garelli等(2012)和Colombani等(2012)的研究结果进行了总结；Hackney和Cherbas(2014)论述了多种类型的损伤会导致生物生长延迟，其中提到了蜕皮激素和Dilp8可能参与这一过程；Gontijo和Garelli(2018)对Dilp8和Lgr3之间相互作用的方式和功能进行了阐述；另外3篇综述(Juarez-Carreoetal.,2018;Delanoue and Romero,2020;Texadaetal.,2020)在阐释生物生长过程中影响体型大小、对称性和生长发育的多种因素时，提到Dilp8在其中的作用。目前还缺乏对Dilp8功能和作用机制进行系统性论述的文章。本文对Dilp8的受体Lgr3进行了简单论述，总结了研究者们发现的Dilp8的功能及在分子水平上的作用机制，补充了对Dilp8的最新研究结果。

1 Dilp8的受体Lgr3

Dilp8的受体是Lgr3，是高度保守的松弛素家族肽受体(relaxin family peptide receptors,RXFPs)家族的成员。在果蝇幼虫，Lgr3主要在中枢神经系统中腹侧神经索(ventral nerve cord,VNC)的4个神经元内表达，它通过作用于中枢神经系统神经元中的一个新亚群，在Dilp8依赖的发育稳定性通路中发挥关键作用(Colombanietal.,2015;Garellietal.,2015;Jaszczaketal.,2016)。在果蝇成虫中，Lgr3在大脑和VNC的大量神经元，腹位心的部分外周神经元以及输卵管附近的一组卵泡细胞中均有表达，与Dilp8一起调节雌果蝇的排卵(Liao and Nässel,2020)。此外，有研究表明Lgr3与果蝇的性别特异性调控有关:果蝇的性别调控基因DsxF和FruM调节Lgr3的表达，Fru的B亚型抑制雄果蝇中束中Lgr3的表达，DsxF抑制VNC中Lgr3的表达(Meissneretal.,2016)。

2 Dilp8的功能及作用机制

Dilp8的基因和蛋白结构如图1所示，其蛋白功能结构域还未完全清楚，需要进一步探索。图2为Dilp8与其他7种果蝇胰岛素的蛋白氨基酸序列对比图。虽然Dilp8属于果蝇胰岛素样肽，但其功能与其他7种Dilps相比具有很大的差异。Dilp1,2,3和5主要在幼虫脑中枢神经细胞(median neurosecretory cells,MNCs)中表达，而成蝇MNCs中不表达Dilp1(Grönkeetal.,2010)。Dilp1的主要功能是促进机体生长发育；Dilp2也在成虫盘和唾液腺中表达，主要调节果蝇体内海藻糖的浓度，也是调控果蝇寿命的关键信号；在果蝇幼虫和成虫的肠道肌细胞中也有Dilp3的表达，Dilp3负责调节肠道干细胞的生长增殖，同时也是循环海藻糖的主要调节剂；Dilp4在果蝇胚胎中肠和中胚层中表达，Dilp5在雌果蝇卵泡细胞中也有表达，Dilp4和Dilp5低表达时抑制果蝇生长，过表达时促进生长发育，Dilp5对脂质和碳水化合物的代谢至关重要；Dilp6在果蝇脂肪体和幼虫肠道中表达，促进果蝇从幼虫向蛹的转变，过表达时可以使果蝇寿命延长；Dilp7主要在胸腹神经节中表达，与雌果蝇排卵相关(Broughtonetal.,2008;Grönkeetal.,2010;Biglouetal.,2021;Semaniuketal.,2021)。此外，与Dilp8不同的是，Dilp1-7只有1种已知受体dInR(Drosophilainsulin receptor)(Nässeletal.,2013)。Dilp8的功能如下所述。

图1 Dilp8的基因(A)和蛋白(B)结构Fig.1 Gene (A) and protein (B) structure of Dilp8UTR:非翻译区Untranslated region;CDS:编码序列Coding sequence.蛋白结构示意图来源于UniProt(https:∥www.uniprot.org/)。不同颜色代表AlphaFold预测，用每残基置信度分数(pLDDT)表示结构预测的准确度，数值越高表明置信度越高。The schematic diagram of the protein structure is derived from UniProt (https:∥www.uniprot.org/).Different colors represent the AlphaFold prediction,and the accuracy of structural prediction is expressed by the per-residue confidence score (pLDDT),with higher values indicating higher confidence.

图2 Dilp1-8蛋白氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequences of Dilp1-8 proteins蛋白序列来源于NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)。红色字体表示蛋白序列中的相同氨基酸。The protein sequence is derived from NCBI (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/).Red font indicates identical amino acids in the protein sequence.

2.1 协调果蝇组织生长和发育时间

在动物发育过程中，器官组织需协调生长才能生成具有固定比例和一定对称性的健康个体，而Dilp8在这一功能中起核心作用。Boone等(2016)研究表明，Dilp8突变体果蝇会表现出不对称性，且Hippo通路的转录共激活子Yorkie及其DNA偶联因子Scalloped通过Dilp8启动子中的Hippo响应元件直接调节Dilp8的表达。Pacman是一种高度保守的细胞质核糖核酸酶，从5′-3′方向上降解RNA，Jones等(2015)研究表明，Pacman会抑制Dilp8的表达。Heredia等(2021)发现Dilp8-Lgr3通过抑制幼虫角质层硬化和控制幼虫唾液腺分泌“胶”的扩散参与果蝇蛹化过程，并且作用于20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20HE)信号的下游，同时他们认为Dilp8可能属于蛹固定化因子/前缩因子(puparium immobilization factor/anterior retraction factor,PIF/ARF)。DaCrema等(2021)研究发现果蝇翼盘上皮屏障通过将Dilp8与血淋巴物理隔离来限制Dilp8的作用，从而进一步抑制大脑和前胸腺的信号传导，这一过程决定了再生检查点的持续时间；他们还证明了Dilp8通过Lgr3抑制蜕皮素的产生。以上是在果蝇正常发育过程中Dilp8的已知作用，其中的具体调控机制还不完善，需要进一步的研究。

果蝇在生长过程中受到损伤时，Dilp8会通过延长发育时间来缓解损伤，以确保果蝇生长为体型正常和具有对称性的个体。研究表明，Dilp8表达会导致果蝇幼虫蛹化时间延长，体型差异变小，不对称性减小(Garellietal.,2012)。当损伤发生时，会有一系列通路被激活来调控Dilp8的表达。在凋亡细胞中，PERK/ATF4通过激活Rac1和Slpr来激活JNK通路，进而导致Dilp8的表达(Demayetal.,2014)。当幼虫受到损伤时会激活JNK信号，进一步激活Upd/JAK/STAT信号通路，从而导致Dilp8的表达(Katsuyamaetal.,2015)。Skinner等(2015)研究表明，染色质修饰基因trithorax负调控puckered(JNK信号的靶基因)的表达，从而调控JNK通路和Dilp8的表达。Boulan等(2019)发现，核糖体小亚基蛋白RpS12会触发应激反应转录因子Xrp1的表达，从而起到调控Dilp8的作用。Sanchez等(2019)研究表明，果蝇生长异常会激活Dmp53下游的Eiger-JNK信号通路，进而激活Dilp8的表达。Ray和Lakhotia(2019)的研究表明，在果蝇蛹早期发育阶段激活Ras/JNK驱动的Dilp8会对机体内稳态产生不利影响。Dilp8被激活后，通过激活双侧脑间Lgr3-阳性神经元的cAMP信号来激活Lgr3受体(Garellietal.,2015)。这导致脑间部Lgr3阳性(pars intercerebralis Lgr3-positive,PIL)神经元和生长协调Lgr3(growth coordinating Lgr3,GCL3)神经元功能的增加，PIL/GCL神经元将信号传递到前胸腺(Gontijo and Garelli,2018)。随后，disembodied和phantom的表达会降低，从而抑制蜕皮素的合成来延缓果蝇发育(Vallejoetal.,2015)。Karanja等(2022)证明了受损成虫盘中的蜕皮素信号对于Dilp8的上调是必要的。同时，Dilp8/Lgr3通过抑制大脑胰岛素产生细胞中Dilp3和Dilp5的产生，并将信息传递给促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone,PTTH)神经元，进一步抑制保幼激素的合成，来平衡果蝇的生长和生长周期，若Dilp8/Lgr3失衡，果蝇体型会出现不对称性(Garellietal.,2012;Hackney and Cherbas,2014)。此外，Jaszczak等(2015)研究表明，Dilp8通过激活前胸腺中的一氧化氮合酶(NOS)来抑制蜕皮激素的产生，随后他们发现Lgr3位于NOS的上游(Jaszczaketal.,2016)。

2.2 调节雌果蝇的排卵

Liao和Nässel(2020)的研究表明，在成年果蝇中，Dilp8主要在雌果蝇卵巢中成熟卵子周围的卵泡细胞中表达，其受体Lgr3在中枢神经系统和输卵管附近的卵泡细胞中表达。Dilp8既可以作用于输卵管肌神经元，使输卵管收缩，也可以通过旁分泌效应直接作用于卵泡细胞，诱导卵泡破裂和随后的排卵。Dilp8表达降低时，果蝇产卵量减少，而卵巢中保留的卵子数量增多，说明卵巢中的Dilp8表达降低对雌果蝇的排卵有抑制作用。

2.3 肿瘤源性Dilp8与厌食症有关

肿瘤组织分泌的Dilp8与Lgr3结合后，通过上调大脑中的厌食性核连蛋白1(nucleobinding 1,NUBC1)，下调促食欲短神经肽F(short neuropeptide F,sNPF)和NPF的表达，使果蝇食欲下降，而抑制Dilp8的表达可逆转厌食表型(Yeometal.,2021)。Dilp8与人类肿瘤患者体内分泌的胰岛素样肽3(insulin-like peptide 3,INSL3)同源(Yeometal.,2021)。在正常情况下，INSL3在男性中主要在睾丸间质细胞表达，与胎儿的睾丸下降有关，在孕妇妊娠中期时，若胎儿为男性，则可在羊水中检测到INSL3，若胎儿为女性则检测不到(Anand-Ivelletal.,2011)。男性青春期时INSL3的水平持续升高，与睾丸体积和生殖能力相关，此外还与甲状腺和骨骼等功能有关(Assisetal.,2016;Ferlinetal.,2018;Minagawaetal.,2018;Esteban-Lopez and Agoulnik,2020)。在女性中，INSL3主要在卵巢的黄体细胞和卵泡膜细胞中表达，与雌激素的分泌和生殖能力有关(Esteban-Lopez and Agoulnik,2020;Pitiaetal.,2021)。人体肿瘤分泌的INSL3同样与患者的食欲减退有关(Yeometal.,2021)。INSL3的受体是RXFP2，后者与果蝇Lgr3同源(Fengetal.,2007;Shokrietal.,2020;Yeometal.,2021)。

3 小结与展望

综上，目前对果蝇Dilp8的研究整体尚处于起步阶段，无论是其基因结构和功能，还是其对果蝇生长发育、受损组织修复和排卵能力等的调控机制和通路还存在着相当的知识空白。本研究对自其被发现到如今10年时间里的研究进行了系统综述，总结了前人发现的Dilp8参与协调果蝇组织生长发育和调控雌果蝇排卵代谢等生理过程。未来对Dilp8的研究具有重要意义，生物生长的对称性和协调性是一个尚未解决的科学问题，随着对Dilp8更深入的了解必然会推动该方面研究，同时也对避免产生畸形生物以及推动人类优生优育的研究提供了一个新的思路。此外，INSL3在女性生殖方面的功能尚不清楚，Dilp8可辅助人们对这一功能的研究。且肿瘤源性Dilp8的发现对癌症患者厌食症的治疗具有重要意义。值得注意的是，Dilp8/Lgr3与人类INSL3/RXFP2高度同源，对果蝇Dilp8深入全面地探索对于人类疾病的临床转化研究具有很大的应用前景。尽管目前对于果蝇Dilp8的研究较为缓慢，但随着测序技术和一些新兴分子生物化学技术的发展，对Dilp8及其受体与调控机制的分析会倍道而进，Dilp8的研究正迎来春天。