PTEN/ILK信号通路对子宫内膜癌细胞增殖作用及机制*

代丽丽, 葛静, 王景, 刘晶, 王旭, 陈然

河北医科大学第一医院妇产科(河北石家庄 050030)

子宫内膜癌是妇女生殖道常见的三大恶性肿瘤之一，严重威胁女性健康。该病的发生、发展涉及多因素，是一个多步骤的复杂过程[1]。研究子宫内膜癌发生、进展的分子机制对于鉴别肿瘤良恶性、判断恶性肿瘤预后以及寻找新的有效治疗靶点具有重大的现实意义[2]。增殖与转移是子宫内膜癌的重要特点之一，是造成患者死亡的主要原因[3]。大量研究表明，恶性肿瘤中整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的表达与肿瘤的增殖密切相关。近年文献报道，ILK在几种人类肿瘤中的表达显著增高[4]。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)是维持正常细胞生存所必需的肿瘤抑制因子，具有磷酸酯酶活性。PTEN能够调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭等过程，进而抑制肿瘤的发生发展[5]。人类多种癌症中发现，PTEN的失调可导致其抑癌功能减弱，对于癌症研究有重要意义。因此本研究采用体内检测结合体外研究的方法，探讨PTEN与ILK二者之间的关系及其对子宫内膜癌增殖和迁移的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 RL95-2、Ishikawa和HEC-1B细胞购自中科院上海细胞库；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶消化液购自HyClone；青链霉素混合液、4%多聚甲醛购自北京碧云天有限公司。

1.2 患者资料 选取河北医科大学第一附属医院在2018年1月至2021年12月期间手术切除的子宫内膜癌组织243例(肿瘤组)和癌旁正常组织37例(对照组)。纳入标准：经病理检查确诊均为原发肿瘤；排除标准：行术前新辅助放化疗，伴转移瘤、复发肿瘤,伴有心脑血管疾病及其他手术禁忌证。临床资料收集患者的肿瘤分期以及患者生存期等指标，分析PTEN与ILK蛋白表达与临床病理特征以及预后的相关性(生存分期收集近3年内术后子宫内膜癌癌患者数据)。所有患者治疗均以手术切除为主。

本研究经过本院伦理委员会批准(20190454)。

1.3 免疫组化 标本组织依次进行石蜡切片、脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、加PTEN与ILK(1∶1 000)一抗、加二抗、DAB显色、复染细胞核、脱水封片以及切片扫描仪扫描分析。免疫组织化学染色结果的评估标准：细胞质中出现棕色或棕黄色颗粒的细胞，或染色>25%的细胞为阳性细胞。平均阳性染色面积百分比法分析免疫组化结果，实验重复3次。

1.4 细胞转染 转染前1 d，将细胞用胰酶消化，计数，接种6孔板，使转染日细胞融合度为80%。在100 μL无血清DMEM培养基中分别加入2 μg pcDNA3.1-NC及pcDNA3.1-PTEN，再分别和100 μL含10 μL Lipofectamine的无血清DMEM培养基混合为转染试剂，室温保温30 min。用无血清培养基清洗细胞后每孔加入0.8 mL无血清DMEM培养基，加入0.2 mL 转染试剂。对照组细胞不加转染试剂，其他两组细胞分别加入含 pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-PTEN的转染试剂。37℃、5%CO2培养5 h，加入含血清DMEM培养基培养48 h后换筛选培养基。筛选培养基G418的浓度为500 μg/mL。筛选培养约20 d，获得稳定转染细胞株。

转染前1 d，对数期细胞在6孔板中过夜，密度为3×105/well，每孔放2.5 mL不含抗生素的生长培养基。待细胞生长密度达60%，细胞中去除生长培养基，加入1.5 mL新鲜的不含血清的生长培养基。对于每个转染的孔，按照如下方法分别准备si-NC，si-ILK (50 nmol/L)和 Lipofectamine RNAiMAX 混合物，在250 μL的无血清生长培养基中加入100pmol siRNA，柔和混匀。Lipofectamine RNAiMAX使用前先混匀，然后在250 μL生长培养基中加入5 μL，Lipofectamine RNAiMAX进行稀释，室温下温育5 min。混合稀释好的siRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室温下温育20 min。加入混合物到含有HeLa cells的6孔板中，每孔终体积为2 mL，并轻晃混匀。在37℃的CO2培养箱中培养细胞 5～6 h。更换含有血清的培养基并培养细胞48 h，转染36 h后收集细胞，以验证转染效率，供后续使用

1.5 CCK-8 RL95-2、Ishikawa和HEC-1B中敲减ILK表达和过表达PTEN，培养细胞密度达70%，收集细胞制备为1×104·mL-1细胞悬液。96孔板每孔添加细胞悬液100 μL，分别于0、24、48、72 h加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值。

1.6 Western blotting 调整细胞数6×104·mL-1，细胞汇合度达70%左右，收集细胞，细胞裂解液冰上裂解30 min，然后在4℃ 15 000×g下离心30 min，随后4℃离心吸取上清即提供总蛋白质。随后蛋白质定量后并计算上样量，加上样缓冲液，样品100℃煮5 min。SDS-PACE凝胶进行电泳，电泳结束后将目的蛋白质转至PVD膜，脱脂牛奶封闭。然后在4℃下与初级抗体一起孵育过夜，ILK(1∶1 000)、PTEN(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)，次日再与二抗孵育，PBS清洗，ECL发光仪进行发光拍照，Image-J软件分析western blot灰度值。

1.7 统计学方法 应用 SPSS 20.0统计软件，组间比较用t检验，多组比较用F检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN和ILK在子宫内膜癌肿瘤组织中的表达 PTEN阳性面积在对照组正常子宫内膜组织为(37.04±10.54)%显著高于肿瘤组中阳性面积(9.22±1.76)%；而ILK在子宫内膜癌肿瘤组织中阳性面积为(29.19±8.87)%显著高于正常组织(12.34±2.43)%。见图1。

注：与对照组相比**P<0.01，***P<0.001，标尺=20 μm

2.2 PTEN和ILK与子宫内膜癌患者病理特征间的关系 PTEN阴性和ILK阳性与子宫内膜癌进展期加重、病理分级严重性、肿瘤组织浸润性以及ER、PR和Ki-67呈显著正相关，见表1。

表1PTEN和ILK与子宫内膜癌患者病理特征间的关系 例(%)

2.3 PTEN和ILK对子宫内膜癌患者预后生存期的影响 术后随访243例患者的生存期材料，通过生存期分析，发现PTEN低表达患者中位生存期为27.98个月；PTEN高表达患者中位生存期为32.78个月(图2-A)；ILK低表达患者中位生存期为29.87个月；ILK高表达患者中位生存期为18.9个月(图2-B)。

注：A： PTEN表达与患者预后生存期关系；B：ILK表达与患者预后生存期关系

2.4 PTEN和ILK对子宫内膜癌细胞系增殖能力影响 敲减ILK表达后，在24～72 h，RL95-2细胞增殖OD值在0.32±0.05～0.74±0.15，对照组细胞增殖OD值在0.37±0.01～0.89±0.03(图3-A)；Ishikawa细胞增殖OD值在0.32±0.06～0.98±0.12，对照组细胞增殖OD值在0.46±0.04～1.13±0.36(图3-B)3；HEC-1B细胞增殖OD值在0.39±0.07～0.95±0.27，对照组细胞增殖OD值在0.48±0.05～1.07±0.32(图3-C)。

过表达PTEN后，在24～72 h，RL95-2细胞增殖OD值在0.35±0.08～0.67±0.03，对照组细胞增殖OD值在0.37±0.01～0.89±0.03(图3-A)；Ishikawa细胞增殖OD值在0.37±0.06～0.75±0.13，对照组细胞增殖OD值在0.46±0.04～1.13±0.36(图3-B)；HEC-1B细胞增殖OD值在5.76±0.98～9.23±1.23，对照组细胞增殖OD值在0.34±0.05～0.79±0.18(图3-C)。

注：A 敲减ILK和过表达PTEN后RL95-2细胞增殖；B：敲减ILK和过表达PTEN后Ishikawa细胞增殖；C： 敲减ILK和过表达PTEN后HEC-1B细胞增殖(与pcDNA组相比*P<0.05, 与NC组相比**P<0.01)

2.5 PTEN通过调控ILK的表达发挥抑制子宫内膜细胞增殖作用 与对照组细胞相比，ILK随着PTEN过表达，在RL95-2细胞中表达仅为对照组细胞23/100，在Ishikawa细胞中表达仅为对照组细胞6/25，在HEC-1B细胞中表达为对照组细胞2/5(图4)；与对照组细胞相比，PTEN随着ILK敲减，在RL95-2、Ishikawa和HEC-1B中表达差异无统计学意义(图5)。

图4 过表达PTEN后子宫内膜细胞细胞ILK表达(与pcDNA组相比***P<0.001)

图5 敲减ILK后子宫内膜细胞细胞PTEN表达(与siRNA组相比***P<0.001)

3 讨论

子宫内膜癌已经成为威胁女性健康的一类恶性疾病，其发病率在女性群体中逐年增高[7]。虽然目前关于子宫内膜癌发生发展的分子机制研究已有很多，但是因其复杂的致病因素和发病机制，目前尚无明确有效的临床治疗靶分子。本课题组经过研究提出一种可能的潜在对子宫内膜癌治疗具有一定作用的分子通路，即PTEN/ILK信号通路对子宫内膜癌作用。

PTEN是维持正常细胞生存所必需的肿瘤抑制因子，已经发现其在多种肿瘤发生过程中发挥抑癌作用[8-9]，主要是通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥作用[10]。但是其在子宫内膜癌中的研究较少，已有的研究更多关注PTEN对子宫内膜癌的早期诊断价值[11]，忽略其对肿瘤发展重要因素增殖能力的影响。ILK对细胞生长、分化、黏着和迁移具有关键的调控作用[12]，在多种肿瘤研究中发现其可能发挥促癌作用[13-15]，与PTEN发挥作用相反。在子宫内膜癌研究中，前期研究者关注了ILK对子宫内膜癌病理分期分型的影响，对ILK与子宫内膜癌细胞增殖之间的关系和机制探讨较少。因此本研究重点在前期文献报道基础上进一步关注PTEN/ILK对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。

通过免疫组化检测PTEN/ILK在子宫内膜癌中的表达，发现PTEN在子宫内膜癌患者肿瘤组织阳性面积大于正常组织，而ILK表达则相反，进一步分析PTEN/ILK与患者病理分级、肿瘤分期还有是否发生淋巴结转移，结果均提示PTEN在子宫内膜癌中可能发挥抑癌作用，ILK发挥促癌作用，这一结果通过子宫内膜癌患者术后生存期分析进一步得到验证。上述研究和数据统计分析，均明确PTEN和ILK分别与子宫内膜癌患者病理特征等之间的关系，为体外研究提供一定基础。

体外研究以子宫内膜癌细胞系RL95-2、Ishikawa和HEC-1B为研究对象，三株细胞系分别过表达PTEN表达，敲减ILK表达，细胞增殖实验发现随着ILK敲减，24～72 h内三株细胞增殖能力显著降低，而过表达PTEN后24～72 h内三株细胞增殖同样被抑制，结果说明PTEN能够发挥抑制子宫内膜癌细胞增殖作用，而ILK发挥作用相反，起到促增殖作用。有文献指出PTEN能够调控PI3K/AKT信号通路，而ILK依赖于PI3K/AKT信号通路发挥作用[10,15]，因此接下来本研究重点关注PTEN与ILK之间的调控调控关系，结果提示随着PTEN的过表达，ILK表达显著降低，而敲减ILK对PTEN的表达无显著影响，提示PTEN位于ILK的上游，发挥调控作用，抑制子宫内膜癌细胞增殖。进一步证实PTEN和ILK在子宫内膜癌中存在密切相关的关系，对子宫内膜癌发生发展至关重要。

综上所述，本研究初次研究了PTEN和ILK二者在子宫内膜癌中的相互关系以及其对子宫内膜癌细胞增殖作用影响，结果表明PTEN很可能通过负调控ILK的表达在子宫内膜癌中发挥抑制细胞增殖作用，有望成为子宫内膜癌新的治疗靶点。但是本研究具有一定的局限性，PTEN和ILK之间具体的调控机制如何，本研究尚未完全解释清楚，二者是通过PI3K/AKT信号通路相互调控，还是通过其他信号通路发挥作用，将是我们下一步研究的重点。

利益相关声明：论文内容不涉及相关利益冲突。

作者贡献说明：实验设计为葛静、代丽丽和陈然，实验实施为代丽丽，王景、王旭、刘晶进行实验评估，代丽丽执笔，陈然审校。