生防菌复合基质对西瓜幼苗的促生作用及枯萎病的防治效果

崔梦娇，杨 洋，李敬蕊，吴晓蕾，宫彬彬，高洪波，吕桂云

（河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071000）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum ＆ Nadai]是世界第5 大水果，中国的西瓜种植面积最大、总产量和人均消费量均最高（FAO，2017）。因为多年连茬种植，西瓜枯萎病日益严重，在西瓜生产中造成了重大的产量损失，病田可减产30%～80%，甚至绝产，枯萎病成为西瓜生产中主要限制因素之一［1-2］。西瓜枯萎病的防治方法主要有培育抗性品种、轮作、嫁接、化学防治等，但市场上尚无能对西瓜枯萎病所有生理小种产生抗性的品种，且还存在病原菌发展进化的问题［3］；由于我国人均土地占有面积较少，轮作措施不易实行；嫁接要求较高的技术和成本，且容易对西瓜品质造成影响［4］；化学防治会造成农药抗性、农药残留、环境污染，且目前为止还没有能够有效控制枯萎病发生的化学药剂［5］。生防菌以绿色、无污染、保护生态环境的优势成为目前的研究热点。近年来，在利用生防菌防治土传病害方面的研究已取得了一定的进展，筛选出的生防菌包括木霉菌（Trichodermaspp.）［6］、链霉菌（Streptomycesspp.）［7］、假单胞菌（Pseudomunasspp.）［8］、芽孢杆菌（Bacillus subtili）［9］、放线菌（Actinomycetes）［10］等，并在生产中起到一定效果，但因受各种环境因素和土壤因素的影响，生防菌田间防控效果存在不稳定的问题［11］。利用育苗期间将生防菌添加到育苗基质里，可以提早让生防菌定殖在植株根际，通过大量繁殖形成生物屏障，提高植株定植后的防病效果，并可以减少生防菌用量［12］。目前，生防菌功能育苗基质已在棉花黄萎病［13］、烟草青枯病［14］、香蕉枯萎病［15］、黄瓜枯萎病［16］中得到应用，但关于西瓜枯萎病生防菌功能基质的研究还未见报道。

本试验在前人研究的基础上，在西瓜育苗基质中添加生防菌剂，进行育苗、枯萎病防治效果试验，探究生防菌复合基质对西瓜幼苗的生长和枯萎病的影响，以期为西瓜枯萎病功能性生防菌基质的研发提供依据，为西瓜枯萎病绿色防治提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西瓜品种‘早佳8424’；试验用育苗基质为山东商道生物科技股份有限公司育苗基质；枯萎病菌生理小种1（Fusarium oxysporumf. sp.niveumrace 1）由河北农业大学园艺学院实验室保存。选用的6 种生防菌菌剂包括5 种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌剂和1 种多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌剂，均为已在西瓜枯萎病田间防治应用效果比较好的菌剂。具体编号及信息、含量及剂量见表1。

表1 生防菌菌剂列表Table 1 The list of biocontrol bacteria agents

1.2 试验处理

1.2.1 西瓜种子处理 选取饱满优质的西瓜种子在1.5%（有效氯含量）次氯酸钠溶液中消毒20 min，然后清水浸种6 h，在28 ～30 ℃ 培养箱催芽，选取发芽一致的种子播种。

1.2.2 生防菌基质对西瓜幼苗生长及生理指标的影响 试验于2021 年4—6 月在河北农业大学农业科技园温室中进行。将6 种生防菌剂配置成菌液，浓度为25×108cfu/L，将配置好的菌液分别与5 L 育苗基质混合，以只添加灭菌水的基质作为对照（CK），每个处理25 株苗，进行3 次重复。待幼苗两叶一心时，测定各处理西瓜幼苗的株高、茎粗、植株地上部和地下部鲜质量、干质量，叶绿素含量、根系活力，西瓜幼苗根系指标采用台式扫描仪图像分析软件测定，叶绿素含量的测定采用乙醇、丙酮、水体积比4.5 ∶4.5 ∶1。

浸提法，根系活力的测定采用TTC 法，壮苗指数=(茎粗/株高+地下部干质量/地上部干质量)×全株干质量

1.2.3 生防菌基质对西瓜枯萎病的防治效果 待幼苗两叶一心时，各处理选取生长一致的幼苗进行移栽。移栽3 d 后采用灌根法对每株西瓜苗接种10 mL浓度为5×106cfu /mL 的西瓜枯萎病菌菌悬液。接种病原菌10、15 d 后调查西瓜枯萎病的发生情况，计算病情指数及防治率［17-18］。

病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）

防病效果（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100

1.2.4 生防菌基质对西瓜植株维管束的影响 在接种病原菌13 d 时，取各处理相同病害等级的植株进行茎基部横切，用尼康体视镜SMZ1270 观察维管束变色情况，各处理3 次重复。

1.2.5 生防菌菌株对西瓜枯萎病菌的影响 采用平板对峙法［19］，将西瓜枯萎病菌菌饼放于PDA 平板中央，在其两侧2.5 cm 处均放置滤纸片，取2.5 μL生防菌菌液滴于滤纸片上。3 次重复，以只接枯萎病菌菌饼的平板为对照，在28 ℃ 培养箱中培养6 d，测量对照菌落生长直径及对峙培养平板的菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率 =（对照病原菌菌落直径 - 与生防菌对峙培养的病原菌菌落直径）/ 对照病原菌菌落直径×100%

1.3 数据分析

试验数据采用 Microsoft Excel 2016、SPSS 20.0软件进行统计分析，采用 Duncan 新复极差检验法进行多重比较（P＜0.05）检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同生防菌基质对西瓜幼苗生长的影响

不同生防菌基质处理下西瓜幼苗的长势和叶色有明显的差异（图1）。综合所有指标，

图1 不同生防菌基质处理下西瓜幼苗的生长状况Fig.1 The growth of watermelon seedlings treated with different biocontrol bacteria substrates

GXDYB-1 和HBKYB-5 表现最好，西瓜苗株高、茎粗、地上部鲜重、地上部干重均显著高于对照；株高以HBKYB-5 最显著，为对照的127.5%；茎粗以GXDYB-1 效果最好，比对照高37.2%。与对照 相 比， GXDYB-1、HBKYB-4、HBKYB-5 壮 苗指数较大，分别比对照增加33.2%、17.7%、39.2%（表2）。以上结果表明：GXDYB-1 和HBKYB-5对西瓜幼苗促生效果较为显著。

表2 不同生防菌基质对西瓜幼苗生长指标的影响Table 2 Effects of diffrnent biocontrol bacteria substrates on growth of watermelon seedlings

2.2 不同生防菌基质对西瓜幼苗叶绿素和根系活力的影响

叶绿素在光合作用的光吸收中起核心作用。不同生防菌基质处理的西瓜幼苗色素含量有明显差异。GXDYB-1 处理下西瓜苗叶片叶绿素含量显著优于对照和其它处理，SDKYB-2、HBKYB-5 处理下叶片叶绿素含量分别比对照增加115.8%、111.6%。除 JSKYB-3 根系活力与对照相同外，其它5 种生防菌剂对西瓜幼苗的根系活力均有一定的促进作用，HBKYB-5、GXDYB-1、SDKYB-1 促进作用较显著，分别为对照的124.7%、121.2%、120%（图2）。结合上面的结果，GXDYB-1 和HBKYB-5 对西瓜幼苗促生作用可能与其比较强的根系活力有关。

图2 不同生防菌基质对西瓜幼苗叶绿素和根系活力的影响Fig. 2 Effects of different biocontrol bacterial substrates on chlorophyll and root vitality of watermelon seedlings

2.3 不同生防菌基质对西瓜枯萎病防控的影响

6 种生防菌基质处理对西瓜枯萎病均起到了一定的防治作用（表3）。在接种枯萎病菌15 d后，HBKYB-5 处理对枯萎病的防效达到74.05%，SDKYB-1 处理防效也较好，为69.43%，JSKYB-3处理防效最低，仅为37.25%。当西瓜幼苗侵染枯萎病后，幼苗的茎基部会变黄、变褐甚至开裂。如图3 所示，在体视镜下观察各处理茎基部切片，可以看出各处理植株茎基部维管束颜色变化有明显差异，对照处理幼苗维管束褐化最严重，其次是JSKYB-3 和SDKYB-2，HBKYB-5 处理维管束颜色最轻，与其病情指数基本相一致。

图3 不同生防菌基质对西瓜植株维管束的影响Fig. 3 Effects of different biocontrol bacteria substrates on basal cross section root-stems of watermelon plants

表3 不同生防菌复合基质对西瓜枯萎病的防治效果Table 3 The effect of different biocontrol bacteria compound substrates on controlling watermelon Fusarium wilt

2.4 不同生防菌株对西瓜枯萎病菌生长的影响

6 种生防菌菌株与西瓜枯萎病菌生理小种1 的对峙培养结果如图4，抑菌带的产生说明6 种菌株对致病菌均具有拮抗作用，与只接种致病菌的对照相比，培养6 d 后，6 种生防菌的抑菌率为22.38%～56.82%，HBKYB-5 抑菌效果最显著，抑菌圈直径为对照的43.4% ( 表4)。

图4 不同生防菌菌株对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用Fig. 4 Inhibition of different biocontrol strains on mycelial growth of Fusarium oxysporum f. sp. niveum

表4 不同生防菌菌株对西瓜枯萎病菌生长的影响Table 4 Effects of different biocontrol strains on the growth of Fusarium oxysporum f.sp. nivem

3 结论与讨论

生物防治过程绿色安全、保护生态环境，是一种适合农业可持续发展的病害防治方法，尤其是在土传病害的防治上。在西瓜枯萎病的防治中，生防菌主要通过重寄生、竞争作用、溶菌作用、抗生作用、促进植物生长和诱导植物系统抗性等机理来提高西瓜对枯萎病的抗性［20］。张丽荣等［21］观察到木霉菌菌丝附着或者缠绕在病原菌丝上并吸取营养，导致病原菌丝发生变形、断裂、甚至消解；Jiang 等［22］研究发现，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）F21 通过分泌具有抗菌活性的次级代谢产物和诱导西瓜对枯萎病的系统抗性，来抑制枯萎病的生长；Xu 等［23］筛选出一株芽孢杆菌（Bacillus spp.）WB，通过产生抗真菌化合物、破坏分生孢子结构等来控制西瓜枯萎病。本试验中GXDYB-1 和HBKYB-4 对西瓜幼苗的促生作用与其接种病原菌后的防控率不完全一致，说明生防菌的防控效果并不完全受其促生效果的影响；在平板对峙试验中，其中5 种菌剂都能明显抑制枯萎病菌的生长，且抑制率差异不显著，但将其添加到基质中进行育苗后，发现各菌株对枯萎病的防控效果并不一致，说明在育苗基质中添加生防菌对枯萎病的防控效果受多方面的影响，可能与生防菌促生作用、在基质中定殖、对基质中的微生物种群影响等方面都有关系，其具体生防机理还有待进一步研究。

生防菌能够促进植物的生长发育，孙洪宝等［24］研究发现，在枯萎病菌侵染条件下，接种利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02 固态菌剂，提高了西瓜幼苗的净光合速率和植物内源激素含量，幼苗株高、茎粗、鲜重和干重均有增加；梁宏等［25］将添加解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hj1 的新型生物有机肥施用后，显著提高了根际细菌和放线菌含量，通过分泌多种抗生素和激素类物质，促进了植株生长，西瓜植株株高、鲜质量和干质量在所有处理中均为最高；Faheem 等人［7］向盆栽土中施用生物有机肥富集的链霉菌（Streptomyces goshikiensis）YUCU 菌株，西瓜植株的鲜重和干重显著增加。在本试验中，GXDYB-1、HBKYB-5 生防菌基质育苗可显著提高西瓜幼苗的株高、茎粗、地上部鲜重及壮苗指数，结合根系活力数据，推测生防菌可能通过提高根系活力，来促进植株地上部的生长。

生防菌基质是在成品基质中添加有益微生物，使基质具有促进植株生长、防治病害等功能的一类基质。利用生防菌育苗基质的方式来育苗，可以使生防菌在植株苗期定殖，更早发挥防治作用，并可以减少生防菌用量。杨会款［14］应用枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌育苗基质，降低了烟草青枯病的发病率，在发病高峰期相对防治效果可达41.33%；戚秀秀等［26］将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LY11 添加到育苗基质中，水稻纹枯病发病率降低89.32%；张晓琳等［12］发现，基质中添加多粘芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌后的黄瓜枯萎病发病率均显著降低，其中多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）NSY4 处理防治效果最高，可达62.5%。目前关于抗西瓜枯萎病生防菌育苗基质的研究还未见报道，在本试验中，在育苗基质中添加HBKYB-5 对西瓜枯萎病防治效果可达到74.05%，为生防菌育苗基质推广应用提供依据，同时也为西瓜枯萎病的生物防治提供了新方法。