FOXP3与乳腺癌病理特征和预后的相关性研究

姜林宏， 李蕾， 钟山亮， 王丹丹， 张建， 唐金海， 张鹤达

乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤总发病率的30%，且总死亡率仅次于肺癌，占女性恶性肿瘤总死亡率的15%。此外，乳腺癌发病率仍以每年约0.5%的速度继续增长[1]。目前手术、化疗、放疗，靶向治疗等提高了乳腺癌的生存率，但是我们对乳腺癌发病机制和途径的认知仍有很大不足，需要不断寻找乳腺癌新的治疗靶标。

叉头样转录因子(forkhead box protein 3，FOXP3)，是叉头样转录因子家族中的一员，被认为是调节性T细胞(Treg细胞)最特异性的标志[2-3]。Treg细胞是CD4+T细胞的免疫抑制亚群，具有保护性作用，其主要通过抑制T效应细胞的功能来促进肿瘤的生长[4]。PD1可以通过促进FOXP3的表达增加Treg细胞的稳定性[5]。此外，文献发现FOXP3在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，如FOXP3作为wnt/β-catenin信号通路的共激活因子，促进β-catenin-TCF4复合物的形成，同时激活EMT相关的转录因子，进而诱导EMT信号通路，从而促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭转移[6]；FOXP3可以与LINC00885的启动子特异性地相互作用，诱导LINC00885的转录，进而激活EMT信号通路，从而增加子宫颈癌细胞的增殖和侵袭[7]。此外，在乳腺癌中，高剂量的花萼菌素可降低FOXP3的表达，进而减少VEGF 和 MMP-9的表达，从而抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭[8]；此外，FOXPS可以与VEGF启动子相互作用，抑制其转录，从而下调VEGF的表达抑制乳腺癌的血管生成[9]。然而目前关于FOXP3在乳腺癌中的研究较少，本研究分析FOXP3在乳腺癌中的表达及预后，并通过免疫组化进一步分析FOXP3在乳腺癌中的表达，为乳腺癌的诊断及治疗提供更多有利的依据。

1 资料与方法

1.1 UALCAN数据分析 UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)是一个分析TCGA数据库中RNA-seq和临床资料在线数据库，通过肿瘤数据库UALCAN分析FOXP3在乳腺癌和癌旁组织中的表达，及其在不同乳腺癌分子分型及分期中的表达情况[10]。

1.2 Kaplan-Meier生存分析 Kaplan-Meier(http://kmplot.com/analysis/)是一个基于GEO、EGA和TCGA数据库Meta分析肿瘤预后的数据库。将乳腺癌患者以FOXP3 mRNA表达的中位数为界分为高表达和低表达组，根据Kaplan-Meier在线分析FOXP3 mRNA的表达与乳腺癌预后的关系。

1.3 TIMER分析 TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一个评估肿瘤浸润性免疫细胞及其临床意义的在线数据库，利用该数据库分析乳腺癌中FOXP3与肿瘤浸润性免疫细胞的关系，包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。

1.4 免疫组化 选取盐城市第一人民医院病理科2014年至2016年存档的手术切除或活检的蜡块标本101例，经3名有经验的病理医师确诊。临床资料完整；均为女性；年龄36～84岁，中位年龄54岁。本研究经本院医学伦理委员会讨论并通过，患者及家属均签署知情同意书。将乳腺癌组织依次采用二甲苯、梯度乙醇水化、PBS进行脱蜡，柠檬酸缓冲液进行抗原修复，PBS冲洗，内源性过氧化物酶失活，滴加小鼠抗人PD-L1(DAKO，PD-L1试剂盒)、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68多克隆抗体(CD系列是即用型抗体，迈新)，4 ℃冰箱过夜，滴加适量生物素标记羊抗鼠二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗；然后滴加HRP标记的链霉亲和素，PBS冲洗，经DAB显色试剂盒显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，最后荧光倒置显微镜观察PD-L1、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68的表达。

1.5 统计分析 箱形图以TPM值来评估组间基因表达水平的差异，两组间比较采用独立样本t检验，用log-rank检验评价生存差异。采用Spearman相关检验分析表达相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXP3在乳腺癌组织中的表达 通过UALCAN数据库分析，我们发现与癌旁组织相比，FOXP3在乳腺癌组织中表达高，差异有统计学意义(P<0.001)，图1A；进一步分析，在luminal型、HER2 阳性型和三阴性乳腺癌3种乳腺癌不同的分子分型中，FOXP3在肿瘤组织的表达均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.001)，图1B；在淋巴结转移及远处转移的乳腺癌中，FOXP3在肿瘤组织的表达均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.001)，图1C、1D。

注：***为P<0.001图1 FOXP3在癌旁及乳腺癌组织中的表达 1A：FOXP3在癌旁及乳腺癌组织中的表达；1B：FOXP3在癌旁及不同乳腺癌分型中的表达；1C：FOXP3在癌旁及不同级别乳腺癌淋巴结转移中的表达；D：FOXP3在癌旁及不同分期乳腺癌转移中的表达

2.2 FOXP3与免疫浸润细胞的关系 通过TIMER数据库评估FOXP3表达系数和免疫细胞浸润之间的关系，结果显示FOXP3与肿瘤纯度(指肿瘤组织中肿瘤细胞所占的比例)、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的免疫浸润水平均有关，差异有统计学意义(P<0.001)，图2。

图2 FOXP3与肿瘤纯度(2A)、B细胞(2B)、CD8+T细胞(2C)、CD4+T细胞(2D)、巨噬细胞(2E)、中性粒细胞(2F)和树突状细胞(2G)免疫浸润细胞的关系

2.3 乳腺癌患者中FOXP3的预后 通过Kaplan-Meier数据库，评估FOXP3表达与乳腺癌预后的关系。FOXP3+以中位值作为临界值分成低表达组(≤5%)和高表达组(>5%)。相比于FOXP3低表达组，FOXP3高表达组的总生存率(OS)降低(HR: 1.33,P=0.012)，图3A。不同乳腺癌亚型中，仅在HER2阳性型乳腺癌患者中FOXP3的低表达组OS升高(HR:2.01,P=0.023)，图3B。而在luminal型(HR:1.09,P=0.590)(图3C)和三阴性乳腺癌(HR:0.78,P=0.53)(图3D)中，FOXP3的表达与患者的OS无关，差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 不同乳腺癌亚型中FOXP3高表达、低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线 3A：乳腺癌患者中FOXP3高表达、低表达患者总生存率的生存曲线对比；3B：HER2阳性型乳腺癌患者中FOXP3高表达、低表达患者总生存率的生存曲线对比；3C：luminal型乳腺癌患者中FOXP3高表达、低表达患者总生存率的生存曲线对比；3D：三阴性乳腺癌患者中FOXP3高表达、低表达患者总生存率的生存曲线对比

2.4 FOXP3+与乳腺癌临床病理特征的关系 对72例乳腺癌患者进行免疫组化分析，以FOXP3+表达的中位值作为临界值分成低表达组(≤5%)和高表达组(>5%)，发现FOXP3+表达水平与乳腺癌肿瘤大小无关，差异无统计学意义(P>0.05)，但FOXP3+表达与淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 FOXP3+低表达、高表达与乳腺癌临床病理特征的关系

2.5 FOXP3+与免疫细胞标记因子的关系 对免疫细胞标记因子进行免疫组化分析，免疫细胞标记因子均以各自表达的中位值为临界值进行分组，分为CD20低表达组(≤5%)和高表达组(>5%)；CD68低表达组(≤10%)和高表达组(>10%)；CD3低表达组(≤20%)和高表达组(>20%)；CD4低表达组(≤10%)和高表达组(>10%)；CD8低表达组(≤20%)和高表达组(>20%))。发现CD20+的免疫细胞与乳腺癌淋巴结转移和TNM分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)，而其他免疫细胞标记因子(PD-L1、CD68、CD3、CD4和 CD8)与乳腺癌TNM分期无关，差异无统计学意义(P>0.05)，表2。FOXP3+表达水平与CD3+，CD20+，CD68+免疫细胞标记因子有关(P<0.05)，表3。

表2 免疫细胞标记因子表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系

表3 FOXP3+表达水平与免疫细胞标记因子的关系

3 讨论

FOXP3 基因位于Xp11.23，由11个外显子组成，可编码1个由431个氨基酸组成的蛋白质[11-12]。研究发现FOXP3具有肿瘤生物学功能，参与肿瘤的进展，如FOXP3在舌鳞状细胞癌中高表达，且与舌鳞状细胞癌的病理分化和较差的患者生存率相关[13]。在上皮性卵巢癌中，FOXP3过表达可通过降低Ki-67和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的表达减少细胞增殖，同时FOXP3也可以下调MMP2和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)抑制细胞迁移侵袭，另外FOXP3还可能部分通过抑制mTOR和 NF-kB信号通路抑制细胞的增殖和侵袭[14]。本研究发现，与癌旁组织相比，FOXP3在乳腺癌组织中表达更高，且在不同的乳腺癌分子分型中，FOXP3在luminal型、HER2 阳性型和三阴性乳腺癌3种乳腺癌分子分型的癌组织中的表达比在癌旁组织表达高，同时FOXP3在发生淋巴结转移、远处转移的乳腺癌组织中表达高，以上数据提示FOXP3可能与乳腺癌发生、发展有关。通过生存分析发现FOXP3的低表达与总生存率相关，然而在不同的乳腺癌分子分型中进一步分析，发现仅在HER2阳性的患者中，FOXP3低表达者总生存率高，提示着FOXP3高表达不仅与乳腺癌不良预后有关，而且在HER2过表达时，FOXP3的激活可能促进了肿瘤发生侵袭转移或者免疫逃逸或者FOXP3与HER2有协同作用，这需要后续实验进一步验证。既往研究表明FOXP3在调节Treg细胞的分化和发育中发挥着不可或缺的作用，并在肿瘤微环境中发挥重要作用[15]。Treg细胞是一类负免疫调控的T细胞，其可以阻止其他T细胞的活化，躲避免疫系统对肿瘤细胞的监视，从而形成有效的免疫逃逸[16]。例如来源于肿瘤浸润淋巴细胞抑制免疫反应的CD8+、FOXP3+ 、Treg细胞能够抑制初始T细胞的增殖，从而导致前列腺癌的免疫抑制[17]；肝癌细胞中的FOXP3 + Treg可以通过抑制CD8+CTL 的增殖使免疫抑制增强，促进肿瘤进展[18]。为探究FOXP3在乳腺癌中与免疫浸润的关系，我们通过免疫化学标记发现FOXP3+与肿瘤纯度、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的免疫浸润水平均相关。CD68是巨噬细胞最可靠的标记，CD3、CD4、CD8、PDL1主要存在于T细胞表面，CD20是在除浆细胞外的B细胞表面，均参与细胞的免疫调节。因此我们通过不同免疫细胞化学标志物进一步研究了FOXP3与免疫细胞标记因子在乳腺癌中的表达。研究发现FOXP3+与乳腺癌肿瘤大小无关，但与淋巴结转移、远处转移和TNM分期有相关性。而钟恋君等[19]发现在三阴性乳腺癌中FOXP3与组织学分级呈正相关性，与患者肿瘤直径、淋巴结转移均无关，这可能与乳腺癌分子分型有关。同时我们进一步分析PD-L1、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68免疫细胞标记因子在乳腺癌中的表达，发现CD20+与乳腺癌淋巴结转移和TNM分期有关，而PD-L1、CD3+、CD4+、CD8+、CD68+却与乳腺癌肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期无关。而其他研究显示CD4+，CD8+与三阴性乳腺癌肿块大小呈负相关[19]，PD-L1与三阴性乳腺癌淋巴结转移，脉管癌栓呈正相关[20]，CD8+与三阴性乳腺癌组织学分级呈正相关[21]，CD68阳性的肿瘤相关巨噬细胞与淋巴结转移，较差的组织学分级相关[22]，这些结果差异可能与研究标本中乳腺癌分型有关，需要后续研究进一步验证。本研究发现FOXP3+与CD3+，CD20+，CD68+有关，提示FOXP3+可能通过影响肿瘤细胞的抗原呈提，抑制T细胞杀伤能力，从而达到肿瘤细胞的免疫逃逸。

综上所述，FOXP3在乳腺癌组织中高表达，且与淋巴结转移及分期相关，同时FOXP3+与CD3+，CD20+，CD68+免疫浸润细胞相关，有望成为乳腺癌新的标志物，但是目前研究尚缺乏分子机制的探索，FOXP3生物学功能及相关的免疫逃逸机制有待更深入的探究，这将为乳腺癌的临床治疗提供新途径。