乳腺癌间质型循环肿瘤细胞对术后微小残留病灶的评估价值

孔令禹， 辛智芳， 苏传付， 刘丽， 谷兆鑫， 郭宗强， 姚宇锋

乳腺癌是女性最常见的癌症类型之一，占所有新发癌症的16.7%，发病率逐年上升[1]。目前，手术依然是早中期乳腺癌主要治疗手段，手术后的综合治疗极大改善了乳腺癌患者的预后，但仍有30%～40%的乳腺癌患者术后出现局部复发和远端转移[2]。术后2～3年的复发监测、评估至关重要。手术可切除已经形成实体病灶的肿瘤组织，但仍可能有部分癌细胞残存，向周边部位或淋巴结浸润，或随血液定植至患者机体其他部位，无法通过手术清除，也无法通过常规影像学检查发现。这些残存的肿瘤病灶，称为微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)。MRD是导致乳腺癌远期复发的重要原因之一[3]。研究显示，MRD检测可以比影像学提前7～9个月[4]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是指从肿瘤原发灶或转移灶脱落，并进入外周血液循环的肿瘤细胞的总称。CTC包括间质型、上皮型和上皮间质混合型等亚型[5]。其中，间质型CTC(mesenchymal circulating tumor cell，MCTC)具有较强的肿瘤转移侵袭潜能，是肿瘤复发、转移监测的重要标志物[6-8]。本研究对乳腺癌术前和术后MCTC进行富集检测，探索MCTC数量对术后MRD的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择临沂市肿瘤医院2019年10月至2021年4月期间经临床病理证实为乳腺癌准备行手术的治疗患者为研究对象。纳入标准：①经空芯针穿刺活组织检查确诊为乳腺癌；②未接受任何辅助性治疗者；③临床资料完整；④无其他部位恶性肿瘤；⑤自愿接受术前和术后CTC检测。排除标准：①入院前已行肿块切除活组织检查者；②患者依从性差，有精神疾病者。本研究经临沂市肿瘤医院伦理委员会批准(伦理批件号：KY201901)。患者及家属均签署知情同意书。共125例入组；年龄 26～73 岁，平均(52.2±10.8)岁；病理分期为T0～Ⅲ期，其中T0期 2例，Ⅰ期 6例，Ⅱ期 69 例，Ⅲ期 48 例。

1.2 方法 入组患者分别在术前1～2 d与术后7～10 d，首先使用EDTA抗凝剂真空采血管，采集2 ml外周血，然后更换枸橼酸钠抗凝管(ACD抗凝管)采集4～5 ml外周血，作为MCTC富集检测样本。使用CytoSorter®间质型细胞检测试剂盒富集鉴定MCTC。取4 ml待检标本与磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)以1∶1的比例稀释混匀，密度梯度离心后，分离获得外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)层，将细胞沉淀重悬于190 μL细胞保存液，采用CytoSorter®CTC检测系统进行MCTC富集，使用Nikon-Ti-E型倒置荧光显微镜进行免疫荧光染色结果判读，以MCTC≥1个/4 ml为阳性。

统计患者肿瘤病灶直径、病理分期、TNM分期、淋巴结转移、ER表达、PR表达、Ki67表达、HER2表达、分子分型，以及术前和术后MCTC检测结果。所有患者术后随访，随访截至2022年5月31日或死亡日期。

2 结果

2.1 乳腺癌患者MCTC检测结果 微流控芯片CTC检测系统结合细胞表面波形蛋白(cell surface vimentin, CSV)捕获抗体，富集检测乳腺癌患者的MCTC，如图1所示。

图1 乳腺癌MCTC免疫荧光染色检测结果(免疫荧光染色 ×20) 1A:MCTC阳性的荧光合并图；1B:细胞核染色阳性，呈蓝色荧光；1C:MCTC细胞表面波形蛋白阳性，呈绿色荧光；1D:白细胞CD45-藻红蛋白阴性，阳性呈橙色荧光；1E:明场MCTC细胞形态

125例乳腺癌患者中，术前MCTC检测检出率为81.6%(102/125)，乳腺癌患者MCTC检出范围(0～10)个/4ml，平均MCTC检出数量(2.3±1.9)个/4 ml。术后MCTC检出率为68.8%(86/125)，乳腺癌患者MCTC检出范围(0～6)个/4 ml，平均MCTC检出数量为(1.5±1.4)个/4 ml。手术治疗后MCTC下降减少，术前、术后MCTC数量(P=0.000 2)和MCTC数量变化(P=0.000 2)，差异均有统计学意义，见图2。

图2 乳腺癌患者术前和术后MCTC数量分布(2A)和数量变化(2B)比较

2.2 乳腺癌术前术后MCTC水平与临床病理特征相关性分析 术前MCTC水平与肿瘤直径、病理分期、T分期、N分期、Ki67表达、HER2表达、分子分型有关，差异均有统计学意义(P<0.05)；与患者年龄、ER表达、PR表达无关，差异无统计学意义(P>0.05)。术前不同病理分期乳腺癌MCTC检测结果显示，T0～Ⅰ期患者MCTC检出率为62.5%(5/8)，Ⅱ期患者MCTC检出率为75.4%(52/69)，Ⅲ期患者MCTC检出率为93.8%(45/48)。表1。

术后MCTC水平与N分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)；与患者年龄、肿瘤直径、病理分期、T分期、ER表达、PR表达、Ki67表达、HER2表达、分子分型无关，差异无统计学意义(P>0.05)。术后不同病理分期乳腺癌MCTC检测结果显示，T0～Ⅰ期患者MCTC检出率为50.0%(4/8)，Ⅱ期患者MCTC检出率为59.4%(41/69)，Ⅲ期患者MCTC检出率为85.4%(41/48)。T0～Ⅰ期、Ⅱ期患者术后MCTC数量变化差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅲ期患者术后MCTC数量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。表1。

表1 125例乳腺癌患者术前和术后MCTC水平与临床病理特征统计分析 [例(%)]

2.3 乳腺癌患者术后复发影响因素

单因素分析结果显示肿瘤病灶直径越大、病理分期越晚、T分期越高、淋巴结转移、Ki67高表达、术前和术后MCTC数量越多的乳腺癌患者，越容易发生术后复发，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 乳腺癌患者术后复发单因素生存分析[例(%)]

Cox多因素回归分析结果显示，病理分期、N分期、淋巴结转移、ER表达、PR表达、HER2表达、分子分型、术前和术后MCTC数量是影响乳腺癌患者术后复发的独立影响因素，见表3。

表3 125例行乳腺癌改良根治术患者术后复发多因素Cox比例风险模型

2.4 MCTC对乳腺癌患者术后复发的影响

本组随访时间14～32个月，平均随访时间(24.6±4.8)个月。术前、术后MCTC数量≥4个/4 ml的乳腺癌患者手术治疗后复发率高于MCTC数量<4个/4 ml的乳腺癌患者，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3。术前MCTC检测诊断乳腺癌患者手术治疗后复发的灵敏度、特异度分别为64.3%(18/28)、76.3%(74/97)；术后MCTC检测诊断乳腺癌患者手术治疗后复发的灵敏度、特异度分别为100.0%(11/11)、73.7%(84/114)。

注：术前和术后均以MCTC=4个/4 ml为截断值图3 术前(3A)和术后(3B)MCTC数量对乳腺癌患者无复发生存期的影响分析

3 讨论

乳腺癌术后MRD与肿瘤局部复发和远端转移密切相关[9-10]。更早更准地筛选出治疗后复发高危患者，是提高早期乳腺癌治疗后生存的关键。既往基于影像学随访方式复发监测评估无法前瞻性精准预测，随着液体活检技术的发展，基于循环肿瘤细胞(CTC)的临床检测具有广泛的应用价值，获取检测标本的非侵袭性、突破肿瘤的时空异质性等特点，赋予其广阔的研究价值和临床应用前景。有研究结果表明[11]， CTC计数可以检测出三阴性乳腺癌患者新辅助化疗后的微小残留病变，并准确预测疾病复发，单独使用CTC诊断患者MRD的敏感性为62.0%。目前，使用CTC进行乳腺癌术后MRD评估的临床研究比较少，动态监测术前和术后CTC水平可准确预测乳腺癌疾病复发和进展，对术后实时了解患者病情具有重要意义[12]。目前，国内外关于MCTC辅助乳腺癌手术治疗复发监测临床应用研究报道非常少。Jin等[13]使用CytoSorter CTC监测技术平台研究证实术前上皮型CTC检测可以识别出早期复发风险较高的乳腺癌患者，上皮型CTC≥4个/4 ml的患者的两年无复发生存率(recurrence free survival, RFS)和远期无复发生存率(distant recurrence free survival, D-RFS)分别为85.2%和88.9%，该研究的样本量比较少。本研究使用间质型CTC探索乳腺癌复发相关联性，对125例行手术治疗的乳腺癌进行MCTC检测，结果显示，入组乳腺癌患者的复发率为32.8%(41/125)。无论术前，还是术后，MCTC数量≥4个/4 ml的乳腺癌患者手术治疗后复发率显著高于MCTC数量<4个/4 ml的乳腺癌患者(P<0.001)。术前MCTC检测诊断乳腺癌患者手术治疗后复发的灵敏度、特异度分别为64.3%(18/28)、76.3%(74/97)；术后MCTC检测诊断乳腺癌患者手术治疗后复发的灵敏度、特异度分别为100.0%(11/11)、73.7%(84/114)。术前MCTC评估MRD的敏感性与既往研究相似[11]，但术后MCTC可能更准确预测MRD和乳腺癌复发。甘洁文等[14]对已完成根治性手术的患者120例早中期乳腺癌患者进行CTC检测，术后CTC检出率为75.0%(90/120)，CTC检测诊断乳腺癌患者根治手术后复发的灵敏度、特异度分别为89.5%、97.0%，CTC阳性乳腺癌患者根治手术后复发率均高于CTC阴性者(P<0.05)，与本研究结果基本一致。本研究结果进一步证实间质型CTC检测可能辅助乳腺癌MRD评估和复发监测。

影响乳腺癌患者术后复发的危险因素很多，赵港美等[15]选取305例行改良根治术的乳腺癌患者进行近3年的随访调查，乳腺癌患者术后复发率为34.1%(104/305)，Logistic回归分析结果显示，影响乳腺癌患者术后复发的危险因素包括肿瘤直径、TNM分期、腋窝淋巴结转移、ER表达、PR表达等。张勇等[16]研究结果显示，155例行乳腺癌改良根治术患者术后肿瘤复发为31.6%(49/155)，单因素和多因素Logistic回归模型分析结果发现，伴有脉管癌栓、原发肿瘤直径≥5 cm、腋淋巴结转移数目≥4枚、TNM分期为Ⅲ期、组织学分级Ⅲ级及激素受体(ER、PR)阴性是乳腺癌改良根治术后复发的独立危险预测因素(P<0.05)。本研究对125例行手术治疗的乳腺癌患者单因素分析结果显示，乳腺癌患者术后复发率为32.8%(41/125)，肿瘤病灶直径越大、病理分期越晚、T分期越高、淋巴结转移、Ki67高表达、术前和术后MCTC数量越多的乳腺癌患者越容易发生术后复发。Cox多因素回归分析结果显示，影响乳腺癌患者术后复发的因素包括病理分期、N分期、淋巴结转移、ER表达、PR表达、HER2表达、分子分型、术前和术后MCTC数量。本研究结果与既往国内乳腺癌术后复发研究结果基本一致。同时本研究还显示，术前和术后MCTC是乳腺癌术后复发的独立预测因子(P<0.001)。乳腺癌患者术后仍具有较高的复发率，且影响患者术后复发的因素较多，应根据这些高危因素，进行随访和干预，降低术后复发率，改善患者预后。

综上所述，本研究采用的CSV抗体结合微流控纳米芯片的MCTC富集检测技术，在乳腺癌患者术后MRD评估中具有较好的临床应用价值，乳腺癌患者外周血MCTC检测有助于动态监测患者的疾病发生发展和复发转移。目前国内外MRD评估，多采用循环肿瘤DNA(ctDNA)基因测序方法，其检测敏感度50.0%左右[17]，而且其检测周期较长，检测费用昂贵，需要不同时间点多次检测，不适宜临床全面开展MRD评估。将ctDNA测序和CTC计数结合起来可能更准确检测MRD，更准确预测疾病复发，两者联合敏感度可达90.0%以上[11，18]。为更好地探索MCTC检测在乳腺癌患者MRD评估中的应用价值，本研究尚需要进行多中心和大样本量临床研究，同时延长随访时间。相信未来MCTC检测能够为乳腺癌患者的MRD评估和复发转移监测等提供充足的判断依据。