PCDGF和HIF1-α在卵巢癌中的表达及意义

宋玉霞 赵芳 赵涛 周莎莎 王雪娟 郭桦

卵巢癌在女性生殖道恶性肿瘤中致死率最高，由于没有早期症状，>70%的患者在诊断时已经处于晚期[1]。虽然随着彻底的肿瘤细胞减灭术(R0)+铂类为基础的联合化疗方案推广，卵巢癌患者生存有所改善，但晚期患者5年生存率仍徘徊在32%～46%[2]。因此，进一步探讨卵巢癌发生发展、侵袭、转移中相关因子的变化对其早期诊断及预后具有重要意义。畸胎瘤细胞源性生长因子(PC cell-derived growth factor，PCDGF)是颗粒蛋白超家族成员之一，其表达升高可促进肿瘤的发生浸润、转移及血管生成，研究证实PCDGF与肺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤的发生发展相关[3,4]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作为肿瘤微环境中重要细胞缺氧感受分子，介导了大部分的缺氧应激反应，在缺氧环境下能诱导多种蛋白表达，从而促进肿瘤生长[5]。本研究通过对照研究，观察卵巢癌组织中PCDGF及HIF-1α的表达水平，探讨二者表达的相关性及其与卵巢癌患者临床、预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年1月至2015年9月在石家庄市人民医院妇科手术切除的卵巢癌组织82例，选取因子宫脱垂行全子宫双附件切除或BRCA基因检测突变阳性行预防性双附件切除者的正常卵巢组织33例，年龄35～75岁，平均(50.0±12.3)岁;年龄 <50岁39例，年龄≥50岁43例；根据FIGO分期标准：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期49例，Ⅳ期9例；根据肿瘤的组织学分化程度区分：高分化12例，中分化50例，低分化20例；根据组织学分类区分：浆液性56例，黏液性15例，子宫内膜样11例。正常卵巢组患者年龄39～70岁，平均(52.0±11.6)岁，2组患者的年龄比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。患者临床资料完善、病理诊断明确，且均排除其他系统肿瘤，术前均未接受任何抗肿瘤治疗。所有存档蜡块组织重新做常规HE染色且由2名高级职称病理医生复查筛选后方可入组，本研究得到医院伦理委员会批准，且患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 兔抗人单克隆抗体Anti-HIF-1α抗体[EP1215Y](ab51608)、Anti-PCDGF抗体[EPR15864](ab208777)均购自Abcam公司，DAB显色剂、EDTA抗原修复液、二抗SP-9001试剂盒等均购于北京中杉金桥。采用显微镜及多功能图像分析工作站(OLYMPUS，CX21，日本)进行阅片及图像采集。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化：采用S-P免疫组织化学法，检测PCDGF蛋白及HIF-1α蛋白的表达情况，参照试剂盒说明书操作。主要步骤：石蜡组织连续切片4 μm、二甲苯脱蜡后3%H2O2灭活，EDTA(pH值=8.0)抗原修复液进行修复，10%山羊血清封闭，加一抗(PCDGF兔抗人多克隆抗体稀释比例1∶100、HIF-1α兔抗人单克隆抗体稀释比例1∶250)，4℃孵育过夜；PBS液适当冲洗后滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，脱水、封片。

1.3.2 结果判读：PCDGF蛋白主要表达于细胞膜和细胞浆，阳性表现为黄色、棕黄色颗粒；HIF-1α蛋白主要表达在细胞质和细胞核，以出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性反应。免疫组化染色结果半定量分析计数系统，根据染色阳性细胞百分率和染色强度综合计分进行结果判断。由2名高级职称病理医生采用双盲法并独立对切片进行染色评估，每张切片在高倍镜下(200 ×)随机观察10个视野。细胞染色程度: 蓝色、淡黄色、棕黄色、棕褐色，依次评为0、1、2、3分; 阳性细胞数:将阳性细胞比值的0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、> 75%分别评为0、1、2、3、4分。将两项得分相乘后的分值为每张切片的最终评分(0～12分): 0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～8分为中等阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。最终将免疫组化结果划分2组: 低表达组(-～+)和高表达组(++～+++)，其中以高表达组之和计算阳性表达率。

1.4 随访 采用电话或门诊随访。随访时间为术后3～80个月，中位随访时间46个月，随访终点事件为患者死亡或者到达随访截止时间(2020年10月)。

2 结果

2.1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达 PCDGF以细胞膜和细胞浆出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应，在正常卵巢组织中的阳性表达率低于卵巢癌组织(P< 0.001)；HIF1-α阳性表达表现为细胞浆和细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒，在正常卵巢组织中的阳性表达率低于卵巢癌组织(χ2=7.730，P=0.005)。见图1，表1。

图1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌组织中的蛋白表达(SP×200)

表1 PCDGF和HIF1-α在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达 例(%)

2.2 PCDGF和HIF1-α的表达与卵巢癌临床病理特征的关系 PCDGF的高表达与患者肿瘤FIGO分期呈正相关(P=0.029)，而与患者年龄、肿瘤类型及肿瘤分化程度无相关性(P> 0.05)；HIF1-α的高表达与FIGO分期呈正相关(P=0.005)，在浆液性肿瘤组织中的表达高于其他类型肿瘤，差异有统计学意义(P=0.005)，而与患者年龄、肿瘤分化程度无关,差异无统计学意义(P> 0.05)。见表2。

表2 PCDGF和HIF1-α的表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系 例

2.3 卵巢癌中PCDGF与HIF1-α表达的相关性 Spearman等级相关检验结果表明，卵巢癌中PCDGF和HIF1-α蛋白表达呈正相关(r=0.317，P=0.004)。见表3。

表3 PCDGF与HIF1-α表达的相关性 例

2.4 PCDGF与HIF1-α的表达水平与卵巢癌预后的关系 随访5年，82例患者整体生存率为28.1%(23/82)。PCDGF高表达组5年生存率为23.4%(15/645)，低表达组5年生存率为38.9%(7/18)，差异有统计学意义(P<0.05)；HIF-1α高表达组5年生存率为17.0%(8/47)，低表达组5年生存率为48.2%(17/35)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 PCDGF与HIF1-α的表达与卵巢癌患者预后的关系(Kaplan-Meier法)

3 讨论

本研究从缺氧这一肿瘤特有的微环境出发[6-8]，通过检测上皮性卵巢肿瘤组织中PCDGF、HIF-1α的表达，探讨PCDGF、HIF-1α与卵巢癌病理特征及临床预后之间的关系；

PCDGF作为一种自分泌生长因子与多种肿瘤的发生、侵袭及细胞存活密切相关。黄权生等[9]研究结果显示PCDGF在肺癌患者中高表达。宋鹏等[4]研究表明在鼻咽癌组织中PCDGF呈高表达，且其表达水平与患者差的预后相关。马明忠等[10]在喉鳞癌Hep-2细胞中抑制PCDGF的表达后，发现肿瘤细胞的增殖和侵袭能力受到抑制，细胞凋亡明显增加，以上结果提示PCDGF在多种肿瘤恶性演进中扮演着重要角色。本研究结果表明在卵巢癌组织中PCDGF阳性表达率为78.8%，明显高于正常卵巢组织，且高表达组患者5年生存率明显低于低表达组，与宋鹏等[4]研究结果类似。进一步分析表明PCDGF高表达与肿瘤分期呈正相关，据此我们推测卵巢癌组织中PCDGF高表达可促进肿瘤的侵袭、转移导致肿瘤临床分期进展，并最终影响卵巢癌患者预后。

HIF介导了大部分的缺氧应激反应，根据α亚基的不同，HIF-α可以分为HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-1α是调控缺氧应激的主要成员[11，12]。Magliulo等[13]发现阻断HIF-α表达可以抑制裸鼠移植瘤的生长。HIF-1不仅能降低肿瘤细胞代谢的氧耗量，调节糖酵解作用酶，使其能在缺氧条件下以不耗氧的方式合成三磷酸腺苷，从而促进肿瘤细胞的生长，而且可参与上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管内皮细胞的生长及细胞外基质的形成及促进与癌相关的成纤维细胞的聚集，为肿瘤的转移侵袭创造条件，同时可影响肿瘤的免疫调节。另外，HIF-1α还可以上调P-gp及多药耐药(MDR)基因及耐药蛋白的表达，引起肿瘤耐药[14]。已发现HIF-1α在很多肿瘤中高表达，如乳腺癌、肾癌及结肠癌。近年来有关HIF-1α在卵巢癌中的表达及意义研究也成为热点[15]，本研究发现HIF-1α在卵巢癌组织中高表达主要见于浆液性肿瘤及分期较晚者，提示HIF-1α蛋白的表达与卵巢上皮性癌的潜在恶性生物学行为密切相关，进一步预后分析表明HIF-1α高表达组患者预后明显差于低表达组。施宣忍等[16]研究表明HIF-1α通过调控MMP13表达增强缺氧环境下卵巢癌细胞的侵袭能力。韩煜雯等[17]研究表明，HIF-1α可与BMP4协同作用，参与缺氧微环境的调控，促进上皮性卵巢癌侵袭和转移。这与本研究结果一致。因此，推测HIF-1α可以作为卵巢癌诊断的生物学标志物，并且可以预测卵巢癌患者的预后。

同时，本研究表明卵巢癌组织中PCDGF和HIF1-α蛋白表达呈正相关，这与前期宋鹏等[4]在鼻咽癌中的研究是一致的，提示二者间存在密切关系，但其具体机制尚需进一步研究。

综上所述，卵巢癌组织中PCDGF和HIF1-α表达升高，且其表达水平与患者临床、预后关系密切，表达升高提示患者预后不佳。