AGGF1调控AMPK-mTOR-ULK1信号通路促进视网膜血管生成机制研究

李蓉 姚国敏 周凌霄 闫瑾 张敏 李亚

在对先天性静脉畸形骨肥大综合征患者的研究中，发现了具有多个特殊结构域的新基因，即G补缀FHA域血管生成因子1(angiogenic factor with G patch and FHA domains 1，AGGF1)。该基因广泛表达于人体组织和器官，如脑、眼、心脏等[1]。血管生成是指血管内皮细胞在已形成的毛细血管的基础上原位增殖和迁移，以形成新毛细血管的过程[2]。血管生成涉及多种因素和复杂信号[3]，其中，近年来AGGF1已被证实参与血管发育，具有强烈的促血管生成作用[4]。在血管性疾病领域，AGGF1具有治疗冠心病及心肌梗死[5]、糖尿病血管并发症的潜能[6]。而在肿瘤领域，AGGF1被证实是抗肿瘤血管新生、抑制肿瘤转移的重要靶点[7,8]。研究证实，AGGF1促进了高糖、高氧下的视网膜新生血管形成，可能参与了糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜疾病的病理机制[9,10]。自噬是一种作为对应激的应答、被严格调控的溶酶体降解机制，从而维持细胞内稳态，在生理状态和疾病中均发挥重要作用[11]。我们的前期研究表明，应激状态下视网膜血管内皮细胞自噬的激活参与了视网膜血管生成过程[12,13]。鉴于此，我们推测，激活细胞自噬可能是AGGF1发挥促视网膜血管生成的一种重要机制。本研究拟以视网膜血管内皮细胞为对象，观察AGGF1作用下对细胞迁移和管腔结构形成的影响，进而通过阻断自噬激活的关键信号通路，观察AGGF1对视网膜血管生成的作用是否受到抑制，从而明确AGGF1发挥促视网膜新生血管生成作用的自噬机制，为进一步研究AGGF1在眼部疾病中的治疗潜能和作用靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人视网膜血管内皮细胞(HRMECs，上海中乔新舟生物科技有限公司)；M199培养基、胎牛血清及0.25%胰酶(美国Gibco公司)；人AGGF1重组蛋白(美国Abnova公司)；AMPK 抑制剂Compound C(美国Selleck公司)；Transwell小室及Matrigel(美国BD公司)；细胞RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；兔抗人一抗AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR，ULK1，p-ULK1(美国Cell signaling公司)；兔多抗GAPDH (杭州贤至生物有限公司)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；GFP-LC3B质粒(北京义翘神州生物技术有限公司)；Lip2000转染试剂及Opti-MEM培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)；CO2恒温培养箱(日本SANYO，MCO-15AC型)；倒置相差显微镜(日本Olympus，IX51型)；激光共聚焦显微镜(日本尼康，C2型)；低速离心机(美国Eppendorf，5702R型)；全自动酶标仪(美国Thermo scientific，Multiskan MK3型)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组：将液氮中冻存的HRMECs取出，快速放入37℃水浴锅中解冻，然后转移至含有5 ml M199培养基的离心管中，室温离心收集细胞(1 200 r/min，3 min)；弃去上清后用含10%胎牛血清+1%青霉素、链霉素的M199培养基悬浮细胞，接种至培养皿中，轻轻吹打混匀，在37℃、饱和湿度条件的5%CO2细胞培养箱中培养。用0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞；PBS洗涤细胞2次后离心(1 200 r/min，3 min)；加入完全培养基制成单细胞悬液，按1∶3的比例传代，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下扩大培养。根据不同处理将细胞分为以下3组：对照组(常规培养)，AGGF1组(在M199培养基中加入0.5 μg/ml AGGF1)，Compound C+AGGF1(在M199培养基中加入5 μmol/L的Compound C及0.5 μg/ml AGGF1)，3组细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。

1.2.2 细胞迁移：采用Transwell小室法检测细胞迁移能力。取生长状态良好的细胞，制备单细胞悬液，计数后按照每孔5×105个接种至6孔板，在37℃、饱和湿度条件的5%CO2孵箱中培养过夜。根据上述不同分组处理细胞48 h，0.25%胰酶消化，收集细胞后离心(1 200 r/min×3 min)，弃去上清，PBS清洗2次后用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至2×105/ml备用。在24孔板中加入800 μl M199培养基(含10%胎牛血清+1%青霉素、链霉素)，并放入Transwell小室，在上室分别接入200 μl各组细胞悬液，37℃、5%CO2孵箱中培养48 h。PBS清洗小室，70%冰乙醇溶液固定细胞1 h，0.5%结晶紫染液对细胞进行染色，室温中放置20 min。PBS清洗后用擦净上室一侧未迁移的细胞，在显微镜下观察拍照。每个小室随机选取3个200倍的视野，计数迁移的细胞，取平均值。

1.2.3 细胞管腔形成：采用Matrigel法检测细胞管腔形成能力。4℃条件融化Matrigel胶过夜，并预冷24孔板和移液器枪头。向24孔板加入融化的Matrigel胶，每孔200 μl。低速无菌离心除去气泡，在37℃下孵育30 min。0.25%胰酶消化不同分组培养48 h的细胞，用无血清培养基制成单细胞悬液，计数后按照每孔2×105/个细胞接种至有预铺胶的24孔板中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养过夜。在显微镜下观察拍照，随机选取3个100倍视野，采用Image J图像分析软件计数细胞管腔形成数目，取平均值。

1.2.4 自噬荧光：采用GFP-LC3B质粒转染细胞，观察细胞内的自噬荧光。取生长状态良好的细胞，计数后以每孔5×105个细胞接种于6孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。将要转染的细胞，换成无血清的培养基，培养2 h。取10 μl/孔Lip2000，用200 μl Opti-MEM培养基稀释，混合后室温孵育5 min；取4 μg质粒，用50 μl Opti-MEM的培养基稀释混匀。将稀释的Lip2000和质粒轻轻混合，室温静置20 min，以形成质粒-Lip2000的混合物。将质粒-Lip2000的混合物加入到含有细胞及培养液的培养瓶中，轻轻混匀。转入37℃、5% CO2培养箱培养，6 h后将培养基换成含血清的培养基，然后在37℃、5%CO2培养箱中孵育过夜。根据不同分组处理细胞48 h，在荧光显微镜下观察拍照。随机选取3个400倍的视野，采用Image J图像分析软件计算平均荧光强度。

1.2.5 Western blotting：采用Western blotting法检测细胞AMPK、mTOR及ULK1的蛋白表达。根据不同分组处理细胞48 h，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。将40 μg样品蛋白在10% SDS-PAGE上电泳，然后转移到PVDF膜上。用含5% 脱脂奶粉的封闭液TBST溶液浸泡PVDF膜，室温摇床孵育2 h。磷酸化蛋白用1% 胎牛血清封闭。用稀释的一抗浸泡PVDF膜，在4℃条件下孵育过夜，所用抗体稀释浓度分别为：AMPK(1∶1 000)，p-AMPK(1∶1 000)，mTOR(1∶1 000)，p-mTOR(1∶1 000)，ULK1(1∶1 000)，p-ULK1(1∶1 000)，GADPH(1∶1 000)。TBST充分洗膜后，用稀释的HRP标记的相应二抗(1:50000)在室温下摇床孵育2 h。TBST充分洗膜，除去多余二抗，ECL显色曝光，晾干后扫描胶片，用BandScan软件分析胶片灰度值，与内参照GAPDH的表达进行比较，计算各目的蛋白的相对表达量，每组进行3次生物学重复。

2 结果

2.1 HRMECs细胞迁移情况 3组细胞迁移比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，AGGF1组和Compound C+AGGF1组细胞迁移数均明显增多(P<0.05)。与AGGF1组比较，Compound C+AGGF1组细胞迁移数降低(P<0.05)。见表1，图1。

表1 3组细胞迁移情况比较

图1 显微镜下观察各组细胞迁移情况(标尺=100 μm)

2.2 HRMECs细胞管腔形成情况 3组间细胞管腔形成数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，AGGF1组和Compound C+AGGF1组的细胞管腔形成数均明显增多(P<0.05)；与AGGF1组比较，Compound C+AGGF1组的细胞管腔形成数降低(P<0.05)。见表2，图2。

表2 3组细胞管腔形成数比较

图2 显微镜下观察各组细胞管腔形成情况(标尺=100 μm)

2.3 HRMECs自噬情况 GFP-LC3B融合蛋白荧光检测结果显示三组间荧光强度的总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组细胞中出现较弱的GFP绿色荧光信号，AGGF1组绿色荧光明显强于对照组和Compound C+AGGF1组(P<0.05)；Compound C+AGGF1组的绿色荧光强于对照组(P<0.05)。见表3，图3。

表3 3组细胞GFP-LC3B平均荧光强度比较

图3 激光共聚焦显微镜下观察各组转染GFP-LC3B质粒的HRMECs细胞自噬(GFP-绿色荧光；标尺=100 μm)

2.4 HRMECs中AMPK-mTOR-ULK1自噬信号通路关键蛋白表达情况 Western blotting检测结果显示，与对照组比较，AGGF1组HRMECs细胞自噬被激活，表现为AMPK-mTOR-ULK1信号通路中关键蛋白p-AMPK和p-ULK1蛋白表达条带的明显增强和p-mTOR蛋白表达条带的明显减弱。当采用Compound C处理细胞时，p-AMPK和p-ULK1的蛋白表达则明显减弱，而p-mTOR的蛋白表达则明显增强。对照组、AGGF1组和Compound C+AGGF1组间细胞AMPK、mTOR和ULK1的相对表达量总体比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组、AGGF1组和Compound C+AGGF1组间细胞p-AMPK、p-mTOR和p-ULK1的相对表达量总体比较差异均有统计学意义(P<0.05)。AGGF1组细胞中p-AMPK和p-ULK1值均明显大于对照组和Compound C+AGGF1组(P<0.05)，AGGF1组细胞中p-mTOR值明显小于对照组和Compound C+AGGF1组(P<0.05)。Compound C+AGGF1组细胞中p-AMPK和p-ULK1值均高于对照组(P<0.05)，其p-mTOR值低于对照组。见图4，表4。

图4 3组细胞AMPK-mTOR-ULK1自噬信号通路关键蛋白表达比较

表4 Western blotting检测各组蛋白的相对表达量

3 讨论

由于内皮细胞功能障碍是视网膜新生血管性疾病的主要特征，因此本研究选择HRMECs，一种常用的细胞模型进行观察[14,15]。结果提示，AGGF1直接处理HRMECs可以明显促进细胞迁移和管腔形成，与我们前期在其他视网膜内皮细胞模型中观察到的结果[9,10]一致，证明了AGGF1具有促进视网膜内皮细胞血管生成的作用。目前关于AGGF1促血管生成的机制研究还较少，有研究提示虽然其效应类似于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，但进一步研究发现其作用与VEGF信号通路无关[1,16]。在针对冠心病和心肌梗死治疗策略的研究中发现，维持或增强自噬是增强AGGF1促血管生成的新机制，主要涉及JNK信号通路的激活[16]，但在视网膜血管生成中，AGGF1的作用及分子机制还不清楚。

研究证实，AMPK-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm，TOR)-Unc-51样激酶1 (Unc-51-like kinase 1，ULK1)信号通路对自噬具有重要的调控作用，对该通路的深入研究将有助于更好地理解细胞自噬过程，并为自噬相关疾病的治疗提供新的靶点[17]。已证实多个与自噬相关的特异性基因(ATG)编码相应的蛋白，协同参与自噬体形成的各个阶段。其中，微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)是ATG8在哺乳动物的类似物，广泛分布于哺乳动物组织和培养细胞中[18]。LC3B参与自噬的全部过程[19,20]，通过免疫印迹或免疫荧光检测LC3B已成为监测自噬及自噬相关过程的可靠方法[18]。

本研究采用Compound C作为AMPK信号通路最常用的化学抑制剂[21]，利用免疫印迹和LC3B免疫荧光的方法观察了阻断AMPK-TOR-ULK1途径时，AGGF1对HRMECs细胞血管形成的作用是否受到影响。结果发现Compound C处理细胞时，可显著降低细胞p-AMPK和 p-ULK的蛋白表达水平，增加p-mTOR的表达，最终降低LC3B的表达，与在其他细胞中的研究结果[22]相一致。这些结果均表明AMPK-mTOR-ULK1信号通路与自噬激活有关，而Compound C可有效抑制细胞自噬激活。本研究同时还发现Compound C可明显减弱AGGF1作用下的细胞迁移和管腔形成，提示AMPK-mTOR-ULK1信号通路与AGGF1介导的自噬有关，且通过此通路上调自噬水平是AGGF1发挥促视网膜血管生成效应的一种分子机制。

综上所述，本研究证实了AGGF1通过激活AMPK-mTOR-ULK1信号通路而促进HRMECs的自噬激活，后者最终通过增强细胞迁移和管腔形成能力，发挥促进视网膜血管生成的作用。不过，体外细胞实验结果与体内生理、病理状态存在一定差异，本研究结果还需要在体实验进行验证。另外，本研究只观察了AGGF1对正常状态下视网膜血管内皮细胞的作用，未对病理状态下，如缺氧、高糖的作用和机制进行观察，故不能说明AGGF1在眼部疾病中效应及机制，尚需进一步利用相应的疾病模型进行深入观察。