白花丹素调控锌指E盒结合ZEB1的表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响

赵维波 孔令甲 敬长春

结直肠癌是常见的死亡癌症，已成发展为全球第四致命的癌症，每年约为90万人死亡[1]。在我国结直肠癌发病率和病死率均占肿瘤癌症的第五位，预计至2030年我国结直肠癌发病患者将达到40万例[2]。由于前期缺乏诊断的方法及治疗方式，导致5年预后较差[3]。白花丹素化学名为5-羟基-2-甲基-1,4-萘醌，是从药用植物白花丹根部提取分离而来的，具有抗肿瘤、抗炎等活性[4]。孙瑜针等[5]研究结果显示，白花丹素能有效抑制卵巢癌细胞的增殖和诱导细胞的凋亡，但是对结直肠癌细胞的研究相对较少。锌指E盒结合蛋白1(ZEB1)在胚胎转移分化中起到重要的作用，随着近年研究的不断深入，其具有致癌作用，在胃癌、乳腺癌等高表达，与浸润深度、淋巴结转移等有关[6,7]。钟轩等[8]研究结果显示，干扰ZEB1基因的表达能抑制结直肠癌细胞的增殖和转移，并促进细胞的凋亡。本研究体外培养结肠腺癌细胞SW480，探讨白花丹素是否通过调控ZEB1的表达影响结直肠癌细胞增殖、凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 结肠腺癌细胞SW480购买于中国科学院上海细胞资源中心；胎牛血清、RMPI-1640培养基购买于美国Hyclone公司；白花丹素购买于上海博麦德生物，纯度≥98%；Lipofectamine 2000试剂盒购买于美国Invitrogen公司；si-NC、si-ZEB1、vector、ZEB1由上海吉玛公司设计合成；MTT试剂盒、凋亡试剂盒购买于北京索莱宝公司；Ki67抗体、p21抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、ZEB1抗体、GAPDH抗体购买于美国Abcam公司；BCA试剂盒、化学发光试剂购买于碧云天生物；HRP标记的IgG购买于北京中杉金桥生物。

1.2 细胞培养与分组 SW480细胞常规复苏后，在含有10%胎牛血清的RMPI-1640培养基内，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天更换1次培养液，待细胞生长至85%时，进行消化传代培养。收集处于对数生长期的SW480细胞悬液，调整密度为3×104个/ml，接种在24孔板上，采用终浓度为0、1、2、5 μmol/L的白花丹素处理SW480细胞，分为白花丹素0、1、2、5 μmol/L组；按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将si-NC和si-ZEB1转染至SW480细胞，记为si-NC组和si-ZEB1组；将vector和ZEB1转染至SW480细胞后，采用白花丹素浓度为5 μmol/L进行处理，记为白花丹素+vector组和白花丹素+ZEB1组。

1.3 MTT检测细胞活力 收集各组SW480细胞经过消化后，制成单细胞悬液，调整密度为3×104个/ml接种在96孔板内，分别培养48 h后，在每孔内加入5 mg/ml的MTT溶液(20 μl)，继续培养4 h，每孔内加入150 μl二甲基亚砜溶液，使结晶溶解后，在酶标仪490 nm处检测各组细胞的吸光度值，并据此计算细胞活力。细胞活力(%)=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组SW480细胞，加入胰蛋白酶消化，收集细胞并制成细胞悬液，调整密度为1×105个/ml接种在12孔板内，在4℃、1 000 r/min离心10 min弃上清液。根据凋亡试剂盒说明书将5 μl的Annexin V-FITC及PI溶液与500 μl Binding Buffer混匀，暗室避光反应15 min，置于流式细胞仪检测细胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)。

1.5 Western blot检测Ki67、p21、Bax、Bcl-2和ZEB1蛋白表达 收集各组SW480细胞经过蛋白裂解后，提取各组细胞的总蛋白，按照BCA法检测定量蛋白浓度，取40 μg经过变性的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳处理，分离结束后转移至PVDF膜上，采用脱脂奶粉封闭培养1 h，加入Ki67(1∶500)、p21(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)和ZEB1(1∶800)一抗，4℃孵育过夜，加入带有标记的IgG二抗，37℃孵育1 h。然后加入化学发光试剂进行显影、曝光，采用Image Lab软件分析Ki67、p21、Bax、Bcl-2和ZEB1的蛋白表达，以GAPDH作为内参蛋白。

1.6 qRT-PCR检测ZEB1 mRNA表达 收取各组SW480细胞并添加TRIzol试剂，然后轻轻吹打，提取细胞中总RNA。经过逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA模板，然后配置扩增反应体系，PCR仪器进行扩增反应。反应条件为95℃15 s; 60℃ 60 s,共40次循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算ZEB1 mRNA表达。ZEB1上游引物5’-ACTGTTTGTAGCGA

CTGGATT-3’，下游引物5’-TAAAGTGGCGGTAGATGG

TA-3’；GAPDH上游引物5’-CGAGCCACATCGCTCAGA

CA-3’，下游引物5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

2 结果

2.1 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞增殖的影响 随着白花丹素浓度的增加，细胞活力显著降低(P<0.05)，Ki67蛋白表达显著降低(P<0.05)，p21蛋白表达显著增加(P<0.05)。见图1，表1。

图1 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞增殖的影响

表1 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞增殖的影响

2.2 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞凋亡的影响 随着白花丹素浓度的增加，细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2，表2。

图2 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞凋亡的影响；A 凋亡图；B Bax、Bcl-2蛋白表达图

表2 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞凋亡的影响

2.3 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞内ZEB1表达的影响 随着白花丹素浓度的增加，ZEB1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3，表3。

图3 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞内ZEB1蛋白表达的影响

表3 不同浓度白花丹素对结直肠癌细胞内ZEB1表达的影响

2.4 干扰ZEB1对结直肠癌细胞增殖的影响 与si-NC组比较，si-ZEB1组内ZEB1 mRNA和蛋白表达、Ki67蛋白表达显著降低(P<0.05)，细胞活力显著降低(P<0.05)，p21蛋白表达显著增加(P<0.05)。见表4，图4。

表4 干扰ZEB1对结直肠癌细胞增殖的影响

图4 干扰ZEB1对结直肠癌细胞增殖的影响

2.5 干扰ZEB1对结直肠癌细胞凋亡的影响 与si-NC组比较，si-ZEB1组内细胞凋亡率(早期、晚期凋亡)显著增加，Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表5,图5。

表5 干扰ZEB1对结直肠癌细胞凋亡的影响

图5 干扰ZEB1对结直肠癌细胞凋亡的影响;A 凋亡图；B Bax、Bcl-2蛋白表达图

2.6 白花丹素通过调控ZEB1的表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响 与白花丹素+vector组比较，白花丹素+ZEB1组内ZEB1 mRNA和蛋白表达、Ki67、Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05)，细胞活力显著增加(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图6，表6。

图6 白花丹素通过调控ZEB1的表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响；A 凋亡图；B Ki67、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达图

表6 白花丹素通过调控ZEB1的表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响

3 讨论

结直肠癌发病机制受多种因素的影响，至今尚不明确，临床治疗以手术切除为主，放疗为辅，但是预后效果仍不理想[9]。癌细胞异常增殖和程序性抵抗是导致癌症发病的基础，如何有限抑制结直肠癌细胞增殖和促进细胞凋亡是其关键所在。白花丹具有多种化学成分，白花丹素是白花丹萘醌类化合物，具有抗菌、抗炎和抗肿瘤的作用[10,11]。在骨肉瘤的研究中，白花丹素明显抑制骨肉瘤细胞的增殖和诱导细胞的凋亡，降低Bcl-2蛋白表达，增加Bax蛋白表达[12]，这与本研究结果相似。周群等[13]研究结果显示，白花丹素通过调控JNK通路抑制舌鳞状细胞癌细胞的增值和诱导细胞细胞凋亡。何远桥[14]研究结果显示，白花丹素能有限抑制膀胱癌细胞的增殖和转移，并促进细胞的凋亡。以上均说明白花丹素具有一定的抗肿瘤作用，本研究显示，白花丹素呈浓度依赖性有限抑制结直肠癌细胞的活力，促进细胞凋亡率，上调p21、Bax蛋白表达，下调Ki67、Bcl-2蛋白表达，说明白花丹素能抑制结直肠癌细胞的增殖和诱导细胞的凋亡，具有抗癌的作用。

ZEB1是ZEB家族成员之一，在多种肿瘤内过度表达，与淋巴结转移、病理分类等有关[15,16]，如ZEB1在前列腺癌细胞内高表达，抑制ZEB1通过下调ERK1/2信号通路抑制前列腺癌细胞的增殖和转移，并促进细胞的凋亡[17]。有研究结果显示，ZEB1在结直肠癌组织内高表达，与癌症分期、淋巴结转移密切先关[18]，提示ZEB1与结直肠癌具有重要作用。Li等[19]研究结果显示，沉默ZEB1能抑制结直肠癌细胞的增殖和转移。丁梦[20]研究结果显示，ZEB1是miRNA-141靶基因，miRNA-141通过调控ZEB1抑制结直肠癌细胞的增殖和转移，并促进细胞的凋亡，以上均说明ZEB1可以作为结直肠癌的潜在生物标记物。白花丹素处理SW480细胞，ZEB1 mRNA和蛋白表达下调，提示白花丹素能够抑制ZEB1的表达。利用沉默干扰技术，沉默ZEB1能降低结直肠癌细胞的活力，增加细胞的凋亡率，p21、Bax蛋白表达上调，Ki67、Bcl-2蛋白表达下调，说明抑制ZEB1的表达在结直肠癌内有抗肿瘤的作用。进一步研究白花丹素对结直肠癌的作用，结果发现，过表达ZEB1能够逆转白花丹素对结直肠癌细胞的增殖和凋亡的作用，说明白花丹素能够通过调控ZEB1的表达发挥在结直肠癌内的作用。

综上所述，白花丹素通过调控ZEB1的表达能有效抑制结直肠癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡，为白花丹素抗癌的研究提供了数据支撑。