SDC2基因甲基化检测在结直肠癌筛查中的价值研究

林日旭 郭瑛 谢春明 黄卡特 李剑敏 陈国荣

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，在全球恶性肿瘤中发病率排名第三，病死率排名第二。2018年全球CRC新发病例180万，死亡病例88万，预计到2030年，全球新发病例将超过220万，相关死亡病例达110万[1-3]。大量研究表明，CRC筛查和早诊早治可以有效提高患者生存率，改善预后。目前，CRC筛查和早期诊断的方法有肠镜检查、粪便潜血试验（fecal occult blood test,FOBT）、粪便免疫化学检测（faecal immunochemical test,FIT）等，其中肠镜是发现肠腺瘤和肠癌的金标准，但由于操作的侵入性，肠道准备繁琐，价格昂贵，存在肠道出血、肠壁穿孔、肠系膜、浆膜撕裂、内脏破裂等风险，部分患者不易接受[4-5]。FOBT是目前唯一得到循证医学证实的CRC筛查技术，但检测灵敏度较低[6-8]。FIT相对FOBT检测效率略有提升，但是漏诊率和误诊率均较高[9]。粪便DNA基因检测技术侵入性低、灵敏度高、技术简单且方便，是CRC早期筛查的有效替代方法[10]，现已发现，细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI）2A、分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled related protein,SFRP）2、组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）2、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）等基因的甲基化对CRC早期诊断具有重要价值[11]。重组人黏结蛋白聚糖2（syndecan-2,SDC2）基因位于人类8号染色体的长臂上，编码SDC2蛋白，介导CRC细胞的黏附，进而影响癌细胞增殖[12]。研究已证实SDC2是CRC细胞中主要甲基化位点之一，CRC患者的体液（例如血清和粪便）DNA中可检测到甲基化的SDC2，是检测早期CRC的非侵入性的潜在分子诊断标志物[13-14]。本研究收集了CRC、结直肠进展期腺瘤、干扰癌种患者及正常健康人群的粪便样本进行SDC2甲基化检测，同时采用肠镜检查法进行验证，以此评估人粪便SDC2甲基化检测对CRC的灵敏度和特异度，进而探究人粪便SDC2甲基化检测在CRC早期筛查中的应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2019年7—10月经温州医科大学附属第一医院诊断为CRC、结直肠进展期腺瘤及对照患者共计373例。依据肠镜和（或）病理结果将研究对象分为病例组和对照组，病例组135例，包括CRC 88例，结直肠进展期腺瘤47例；其中男91例，女44例，年龄（61.3±12.3）岁。对照组238例，包括肠癌术后患者26例，其他癌症干扰病例35例（肺癌2例，甲状腺癌4例，淋巴瘤2例，膀胱癌2例，前列腺癌1例，肾癌8例，食管癌9例，胃癌7例），其他肠道疾病患者61例（憩室6例，结直肠黑变病1例，痔疮1例，结直肠息肉18例、结直肠炎症13例、结直肠非进展期腺瘤22例），肠道健康人群116例；其中男140例，女98例，年龄（50.6±14.3）岁。纳入标准：（1）均经肠镜确诊，其中结直肠进展期腺瘤是指最大径≥10 mm的腺瘤和直径＜10 mm且绒毛成分或有高级别上皮内瘤变或腺瘤成分≥25%的腺瘤；（2）合并有其他癌症患者；（3）能提供足量（＞5 g）的新鲜粪便样本。排除标准：（1）受试者在粪便样本采集前30 d内接受化疗、放疗或手术治疗（CRC术后病例无该项要求）；（2）未严格按照粪便样本采集装置说明书要求采集的粪便样本；（3）患者在肠镜检查过程中，进行过肠镜下息肉摘除术或套扎术。本研究经温州医科大学附属第一医院药物临床试验伦理委员会批准（伦理审查号：2019-064），所有入组患者签署知情同意书。

1.2 粪便采集及DNA提取 使用粪便采集装置（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）采集粪便并保存备用；根据DNA提取试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）说明书方法提取粪便DNA，按照EpiTect Bisulfite kit（Qiagen公司）说明书方法进行亚硫酸盐氢盐修饰。除进展期腺瘤或肠癌患者可在肠镜检查后、手术治疗前留取粪便样本外，其余留取粪便样本的时间均为肠镜检查前。

1.3 粪便SDC2基因甲基化检测 按照SDC2基因甲基化检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司，批号：11219070101Z）方法对修饰后的SDC2基因甲基化CpG簇进行荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测。甲基化特异引物为探针1：CGCGACTCCGCGCT，上游引物 1：GGTGAGTAGAGTCGGCGTAGT，下游引物 1：CTCCGAAAACCAATAAACGCCG，非甲基化特异引物为探针2：TCGAAAACTCGAACTCG，上游引物2：GAGGAGGAAGCGAGCGTTTTC，下游引物 2：GAAACAAAATACCGCAACGATTACGACTCAAAC。PCR扩增体系：模板5.0 μl；酶0.3 μl；探针及引物35.0 μl。PCR扩增程序：37℃ 10 min，95℃ 7 min，1个循环；95℃ 25 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，15个循环；93℃ 25 s，56℃ 35 s，72℃ 20s，30个循环。

1.4 判定标准 使用荧光素（fluorescein,FAM）标记的荧光探针1指示SDC2基因甲基化信号，荧光染料（victoria,VIC）标记的荧光探针2指示内参基因β-肌动蛋白（β-actin）信号。测定各样本中反应液的ΔCt值（ΔCt=CtFAM-CtVIC），ΔCt＜10判定样本为“阳性”；ΔCt≥10时判定样本为“阴性”；若反应液CtVIC＜21，且CtFAM信号为“No Ct”，则判读为“阴性”。检测结果解读：“阳性”表示本次检测受检者存在SDC2高甲基化状态，提示CRC、肠进展期腺瘤可能；检测结果“阴性”表示本次检测受检者存在SDC2低甲基化状态，但不排除CRC、肠进展期腺瘤或其他病变的可能。

1.5 统计学处理 采用SPSS23.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。计算粪便SDC2甲基化检测的特异度、灵敏度和总符合率，特异度=真阴性例数（/真阴性+假阳性）例数；假阳性率=1-特异度；灵敏度=真阳性例数（/真阳性+假阴性）例数；假阴性率=1-灵敏度；阳性预测值=真阳性例数（/真阳性+假阳性）例数；阴性预测值=真阴性例数（/真阴性+假阴性）例数；总符合率=（真阳性+真阴性）例数/总样本数；阳性预测值、阴性预测值、总符合率的置信区间采用95%Wilson得分置信区间。以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制ROC曲线，计算AUC。采用Kappa检验做一致性分析，Kappa值＜0.4说明一致性较差，0.4～0.6表示一致性中等，＞0.6说明有较好的一致性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组粪便SDC2甲基化检测的灵敏度 88例CRC患者粪便SDC2甲基化检测总灵敏度为0.841（95%CI：0.748～0.910），性别、年龄、临床分期等各临床特征的灵敏度为0.600～1.000，与总灵敏度比较，差异均无统计学差异（均P＞0.05），见表1。47例结直肠进展期腺瘤患者粪便SDC2甲基化检测总灵敏度为0.553（95%CI：0.401～0.698），性别、年龄等临床特征的灵敏度为0.500～0.625，与总灵敏度比较，差异均无统计学差异（均P＞0.05），见表2。粪便SDC2甲基化检测在CRC患者和结直肠进展期腺瘤患者中的总灵敏度为0.741，假阴性率为0.259。

表1 不同临床特征CRC患者粪便SDC2甲基化检测的灵敏度分析（n=88）

表2 不同临床特征结直肠进展期腺瘤患者粪便SDC2甲基化检测的灵敏度分析（n=47）

2.2 对照组粪便SDC2甲基化检测的特异度 26例肠癌术后患者粪便SDC2甲基化检测的特异度为0.808，35例其他癌症干扰患者的特异度为0.743，61例其他肠道疾病患者的特异度为0.934，116例肠道健康人群的特异度为0.914。对照组238例样本的总特异度为0.882（95%CI：0.835～0.920），假阳性率为 0.118。可见粪便SDC2甲基化检测在其他肠道疾病患者及肠道健康人群中的特异度相对较优，见表3。

表3 对照组粪便SDC2甲基化检测的特异度分析

2.3 粪便SDC2甲基化检测的总符合率及ROC检验粪便SDC2甲基化检测的阳性预测值为0.781（95%CI：0.702～0.844），阴性预测值为0.857（95%CI：0.808～0.896），总符合率为0.831（95%CI：0.790～0.866），见表4。ROC曲线显示，粪便SDC2基因检测的AUC为0.819，可见采用粪便SDC2检测筛查CRC及结直肠进展期腺瘤准确性较高，见图1。Kappa一致性检测结果显示，Kappa=0.63，P＜0.05，可见q-RT PCR检测结果和肠镜检查法存在统计学意义的一致性。

图1 粪便SDC2基因检测CRC及进展期腺瘤的ROC曲线

表4 总入组样本列联表

3 讨论

CRC早期筛查对于疾病发现、治愈至关重要。肠镜是目前诊断肠腺瘤和肠癌的金标准，但由于肠镜检查操作具有侵入性，患者依从率较低[7]。FOBT与FIT检测作为最为广泛的CRC筛查技术，灵敏度和特异度均较低[8-9]。近年来，表观遗传学，如DNA甲基化，在肿瘤早期诊断中的作用受到重视，基于血液、粪便等生物样本的精准无创检测成为结直肠肿瘤诊断的新选择。最近研究显示粪便SDC2甲基化检测对CRC的灵敏度为0.774～0.838，在健康对照中的特异度为0.882～0.980[10，15-16]。本研究探索了粪便 SDC2甲基化作为CRC检测的生物标志物的可行性，结果显示SDC2甲基化检测在CRC中的灵敏度为0.841，在对照样本（肠癌术后人群、其他癌症干扰病例、其他肠道疾病患者、健康人群）中的特异度为0.882。这些数据表明SDC2甲基化检测在CRC早期筛查中具有较高的特异度和灵敏度，可为不愿意接受肠镜检查的CRC风险人群提供新的选择。据报道，FIT检测在腺瘤中的灵敏度为0.270[17]，粪便SDC2甲基化检测在结直肠腺瘤患者中的灵敏度分别为0.582和0.421[15-16]，本研究也发现粪便SDC2甲基化检测在47例结直肠进展期腺瘤患者中的灵敏度为0.553，可见SDC2甲基化检测在CRC癌前病变筛查中也具有指导意义。此外，本研究也纳入了不同疾病的对照样本，结果显示粪便SDC2甲基化检测在肠癌术后人群、其他癌症干扰病例、其他肠道疾病患者、健康人群中均具有较高的特异度。这也揭示了该检测方法可以明显区分CRC患者与其他疾病人群，证实了该检测方法在CRC患者筛查中的高特异度。

研究表明粪便SDC2甲基化水平随着疾病严重程度的加深显著升高[14]。本研究结果也表明SDC2的甲基化检测的灵敏度随着CRC临床分期的增加而增加，但因样本量较小，其结果不具有代表性。据报道，CRC的发病率随年龄的增长而升高，并且在50岁后有较快的上升趋势[18]。本研究发现粪便SDC2甲基化检测在两个年龄段（＜50岁，≥50岁）中均具有较高的灵敏度，表明了该检测方法在各年龄阶段CRC患者及腺瘤患者中都具有较高的适用性。

总之，粪便SDC2基因甲基化检测对于CRC筛查具有较高的灵敏度和特异度，并且与肠镜检查具有较高一致性。因此，粪便SDC2基因甲基化检测有望成为CRC早期筛查的有效手段。