上海地区血液EGFR 基因突变检测室间质量评价回顾分析

范晓瑜 史春丽 肖艳群 王雪亮

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）属受体酪氨酸激酶家族，主要定位于细胞膜。EGFR 被配体激活后启动胞内信号传导，调节转录因子激活基因的转录，参与细胞迁移、黏附、增殖、凋亡等过程。EGFR 突变检测对于接受EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治疗的非小细胞肺癌患者至关重要。肺癌组织中EGFR 突变状态目前被认为是预测TKI 治疗反应和疾病预后的金标准［1］。然而，有时却无法采集到合格的组织样本进行EGFR 突变检测，如无法活检、取样失败或样本量太少等［2-3］，此时需要其它来源的标本行基因突变检测。大量研究表明肿瘤细胞和组织死亡后，肿瘤细胞DNA可以从原发肿瘤灶和/或局部转移部位释放进入血液，此类DNA 称为血液游离DNA（cell free DNA，cfDNA）［4］。cfDNA 进行基因突变检测具有以下特点：1.操作简便；2.可动态追踪疗效。因此利用血液中cfDNA 进行EGFR 突变检测已成为可行的组织样本的替代选择［5］。

目前临床上血液EGFR 突变检测常用方法有扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）、高通量测序（next-generation sequencing，NGS）、数字PCR（Digital PCR，dPCR）等，方法学众多导致检测结果间可能存在差异。同时，cfDNA 片段小［6］、半衰期短［7］、含量低［8］，检测过程繁琐，对操作人员技术和经验要求较高，每个步骤出现问题均可导致检测结果出现问题，从而影响检测结果的准确性。本研究制备可模拟cfDNA 的样本，并将其作为室间质量评价（external quality assessment，EQA）样本开展EGFR 基因突变检测的EQA 活动，以期发现实验室检测过程中所存在问题，达到改进和提高检测质量的目的。

1 材料与方法

1.1 细胞

1.1.1 培养试剂

RPMI 1640 培养基（货号：A1049101）、Ham's F-12K 培养基（货号：21127022）、Leibovitz's L-15培养基（货号：11415064）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS；货 号：10099141C）和 胰 蛋 白 酶（0.25%）（货号：25200114）购自美国Gibco 公司（规格：500 mL/瓶）。

1.1.2 细胞系种类和培养方法

实验所需细胞系、携带突变位点、购买来源和相应的培养方法，见表1。

表1 细胞和培养条件Table 1 Cells and culture conditions

1.2 试剂

DNA 提取试剂盒（德国Qiagen 公司，货号：69506）；游离DNA 提取试剂盒（美国ThermoFisher Scientific 公司，货号：A29319）；双链DNA 高灵敏度荧光定量试剂盒（美国ThermoFisher Scientific公司，货号：Q33231）；人类EGFR 基因突变检测试剂盒（厦门艾德公司，货号：ADx-EG14-LC）；Agilent2100 生物芯片分析系统配套试剂（美国Agilent公司）；dPCR 荧光探针（美国ThermoFisher Scientific公司）；dPCR 配套试剂（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 仪器

二氧化碳培养箱（德国Memmert 公司，型号：INC153）；超声波破碎仪（美国Covaris 公司，型号：LE220）；Qubit 3.0 荧光定量仪（美国ThermoFisher Scientific 公司，型号：Q33216）；生物分析仪（美国Agilent 公司，型号：2100）；液滴数字PCR 仪（美国Bio-Rad 公司，型号：QX200）；荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司，型号：Cobas Z480）。

1.4 质控品制备

培养细胞提取基因组DNA，经超声波破碎仪对各细胞基因组DNA 进行打断，参数如下：功率峰值为450 W，负载比为30%，爆发周期数为200，处理时间为240 秒。打断后得到不同细胞来源的小片段DNA，加入血浆后抽提cfDNA，采用Qubit 3.0 荧光定量仪测定cfDNA 浓度；利用Agilent 2100 生物分析仪分析cfDNA 片段的大小分布；利用QX200 液滴数字PCR 仪分析突变频率，使用QuantsSoft 软件对阴性和阳性液滴数目进行统计后对突变频率进行分析。制备好的样本置于-20℃冷冻保存。

1.5 室间质量评价

EQA 样本盘包括一支野生型样本及四支突变型样本。随机编号后将样本盘经冷链运输至参评实验室，要求其在规定时间内使用其常规检测系统（包括仪器、试剂和方法等）进行检测并回报结果。按临床实验室EQA 要求评价其检测能力，得分100 为成绩优秀，得分80～99 为合格，得分小于80 为不合格，室间质评成绩为符合的样本数/总样本数×100。

2 结果

2.1 样本评估结果

将不同细胞来源的人工模拟cfDNA 片段上机检测，经鉴定其片段长度约160～180 bp，见图1。将其用血浆稀释后，经dPCR 检测证实其突变频率约为0.9%，见图2。ARMS 检测结果显示各制备人工模拟cfDNA 携带突变与预期结果一致。见图3。

图1 cfDNA 片段长度分布Figure 1 The size distribution of cfDNA fragment

图2 突变频率验证Figure 2 Validation of mutation heterogeneity rate

图3 室间质量评价样本荧光PCR 扩增曲线Figure 3 Fluorescence PCR amplification curve of external quality assessment samples

2.2 参评实验室回报情况和室间质量评价结果

2019 年至2021 年分别收到有效回报结果33、29 和27 份。参评实验室最常用的方法为ARMS法（66.7%、75.9%和74.1%），其次为dPCR 法（12.1%、13.8%和14.8%）和NGS 法（21.2%、10.3%和11.1%）。按照结果评价原则，2019 年26 家实验室（78.8%）回报结果完全正确（100 分），4 家（12.1%）成绩合格（80 分），3 家（9.1%）成绩不合格（＜80 分）；2020 年26 家实验室（89.7%）回报结果完全正确（100 分），2 家（6.9%）成绩合格（80 分），1 家（3.4%）成绩不合格（＜80 分）；2021 年26 家实验室（96.3%）回报结果完全正确（100 分），1 家（3.7%）成绩不合格（＜80 分）。见表2。

表2 参评实验室所用方法和检测能力［n（%）］Table 2 Methods and performance scores of participating laboratories［n（%）］

3 次EQA 活动中，样本整体符合率分别为92.7%、97.2%、98.5%。野生型样本未见上报假阳性结果；突变型样本上报结果均出现假阴性情况。其中1912 号样本复合突变（p.T790M+p.L858R）符合率最低，为81.8%，部分实验室仅检出其中一种突变类型，存在漏检情况。见表3。野生型样本和突变型样本的符合率分别为100%（89/89）和94.9%（338/356）。见表4。

表3 EGFR 基因突变检测样本盘组成和室间质量评价结果［n（%）］Table 3 Sample panels of EGFR gene mutation detection and results of external quality assessment［n（%）］

表4 野生型样本和突变型样本的符合率Table 4 Conformity rate of wild type sample and mutant type sample

3 讨论

EGFR 基因突变的准确检测对于靶向药物的选择及预后判断至关重要。在无法获得合格肿瘤组织样本或需动态监测疗效时，血液中cfDNA 可作为组织样本的替代选择。然而血液cfDNA 存在以下特殊性质：①片段较短，约166 bp［6］；②半衰期快，约为16 分钟～2 小时［7］；③含量较低，血液中cfDNA 浓度约为1 000 ng/mL，平均180 ng/mL［8］。由于上述特性，进行cfDNA 检测时易出现抽提失败等原因导致的假阴性结果。此外，由于检测方法学的高敏感性，易造成污染而出现假阳性情况。为保证检测质量，需要采取有效的质量保证措施，如利用合适的cfDNA 质控品监控检测全过程。

cfDNA 质控品制备过程中一个关键环节是对基因组进行剪切以获得片段化DNA，目前主流方法包括超声法和酶切法［9-10］。已有研究利用超声打断基因组DNA 获取cfDNA 样本，用于无创产前基因检测EQA 活动中，结果证实其作为EQA 样本有较好的适用性［10］。本研究通过超声法制备人工模拟cfDNA，鉴定显示cfDNA 片段长度约160～180 bp，加入血浆后检测突变频率约为0.9%，这表明通过超声法制备的cfDNA 质控品可较大程度接近真实血液cfDNA 片段分布，从而较好模拟临床样本。

本中心于2019 年至2021 年利用制备的质控品组织实施血液EGFR 基因突变检测EQA 活动。三次结果显示，成绩优秀实验室分别为78.8%（26/33），89.7%（26/29），96.3%（26/27），表明参评实验室血液EGFR 基因突变检测能力整体较好且逐年提高。三次EQA 回报结果中，符合率最低样本为1912 号复合突变（p.T790M+p.L858R）（81.82%）和1913 号p.L861Q 突变（87.88%），其中分别有83.33%（5/6）和100%（3/3）的结果为假阴性。分析导致样本不符合原因如下：①cfDNA 含量较低且高度片段化，不同提取试剂结合效率差别可能较大［11］；②假阴性结果可能由于EQA 样本突变频率较低，检测人员操作误差造成，如cfDNA 抽提得率低等；假阳性结果可能因为操作过程中交叉污染所致。③假阴性结果中有87.5%（7/8）是由实验室自建方法回报，未进行充分的方法学确认也可能是上述情况发生的重要因素之一。因此，为提高检测质量，实验室可从以下几个方面进行改进：①选择合适的提取试剂，并充分评估cfDNA 抽提效率；②进一步加强人员培训，以减少人员操作失误，也可通过使用全自动核酸提取仪以避免操作误差；③对于实验室自建方法，应进行充分的性能确认后再投入后续使用。

综上所述，利用细胞系制备的血液EGFR 基因突变样本可充分模拟临床样本，达到监控检测全过程的目的。EQA 结果表明大部分实验室EGFR基因突变检测能力良好，但部分实验室检测能力尚需提高。血液EGFR 基因突变EQA 可改进和提高临床实验室检测的整体质量，为临床合理靶向用药提供有效指导。