长链非编码RNA HNF1A-AS1 对口腔癌细胞增殖、侵袭和EMT 的影响

司亚静 张建丽 郑雪莉

口腔癌作为常见的恶性肿瘤，其生存率较低［1］，近年来，口腔癌的发病机制和治疗取得了很大进展，患者通过手术、放疗和激光方法进行治疗，但是口腔癌细胞易向颈部淋巴结转移［2］。由于预后较差，进一步开展口腔癌的研究具有重要意义。长链非编码RNA 超过200 个核苷酸，参与基因表达［3-4］和癌细胞的生物学行为调控［5］，在癌细胞转移中发挥至关重要的作用［6-7］。长链非编码RNA 肝细胞核因子1α反义链1（LncRNA HNF1A-AS1，HNF1A-AS1）是一个新的单外显子基因，含有2 455 个核苷酸，参与多种癌症的进展。Fang 等［8］发现，HNF1A-AS1通过微小RNA-34a（miRNA-34a，miR-34a）/SIRT1/p53反馈环促进结肠癌的转移。另有研究显示，HNF1A-AS1能够促进膀胱癌细胞增殖［9］。然而，HNF1-AS1在口腔癌中的潜在机制仍不清楚。本研究主要评估HNF1-AS1在口腔癌细胞系中的表达，并研究了其对口腔癌细胞体外增殖与转移的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从上海生物细胞研究所选购口腔癌细胞（HSC-6 细胞）和正常口腔上皮角质细胞（HOK 细胞）（货号：12634010，500 mL），反转录试剂盒购于大连Takara 公司（货号：RR036A，200 Rxns），Lipofectamine 2000 购自中国赛默飞世尔科技公司（货号：11668027，0.75 mL），MTT 试剂盒及其DMSO试剂购自上海碧云天（货号：C0009S，500 Rxns），DMSO 试剂购自上海碧云天（货号：ST1276，100 mL）。实时荧光定量PCR 购自西安天隆科技有限公司（型号：Gentier 48E），细胞培养箱购自深圳瑞沃德生命科技有限公司（型号：D180）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、质粒构建及转染

HSC-6 细胞和HOK 细胞在DMEM 培养基中培养。HNF1A-AS1下调和过表达质粒、miR-320d模拟物及其抑制剂由北京擎科生物有限公司合成。细胞转染是使用Lipofectamine 2000 按照制造商的说明进行的。细胞分为①siRNA NC、HNF1AAS1siRNA、PBX3 siRNA 组；②HNF1A-AS1wt+mimics control、HNF1A-AS1 wt+miR-320d、HNF1AAS1mut+mimics control、HNF1A-AS1mut+miR-320d组；③inhibitor NC、miR-320dinhibitor 组；④pcDNA-3.1（+）、pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1、pcDNA-3.1（+）+mimics NC、miR-320dmimics+pcDNA-3.1（+）、pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1+miR-320dmimics 组；⑤PBX3wt+mimics control、PBX3wt+miR-320d、PBX3mut+mimics control、PBX3mut+miR-320d组；⑥siRNA NC+inhibitor NC、HNF1AAS1siRNA+inhibitor NC、siRNA NC+miR-320dinhibitor、HNF1A-AS1siRNA+miR-320dinhibitor 组。转染成功后，分别处理细胞进行检测。

1.2.3 细胞增殖测定

转染的细胞以每孔5×103的密度置在96 孔板中。48 小时后，添加MTT 工作液。孵育4 小时后，取150 μL 二甲基亚砜加入其中，读取540 nm波长下的光密度值。

1.2.4 免疫印迹

提取总蛋白，经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后再转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂奶粉封膜，与特异性一抗和二抗孵育，使用电化学发光观察蛋白条带。

1.2.5 实时荧光定量PCR

细胞总RNA 提取后，反转成互补DNA，通过定量聚合酶链反应测定基因表达量。引物如下：GAPDH-F：ACAGTCAGCCGCATCTTCTT；GAPDH- R：GACAAGCTTCCCGTTCTCAG；HNF1A-AS1-F：TCAAGAAATGGTGGCTAT；HNF1A-AS1-R：GATCTGAGACTGGCTGAA；miR-320d- F：ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA；miR-320d-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCTCTCA；PBX3-F：AGA CGGGAGCTCATCAATCAGACGGGAGGCTAC；PBX3-R：AGAATAAAGCTTCATTAGAATCACCGCCACAA。

1.2.6 双荧光素酶实验

HNF1A-AS1及miR-320d靶基因分析后，构建HNF1A-AS1wt 和PBX3wt 载体。使用点突变试剂盒构建HNF1A-AS1和PBX3突变质粒。使用Lipofectamine 2000 共转质粒转染，最后分析测定荧光素酶活性。

1.2.7 细胞侵袭

matrigel 过夜融化后加入空DMEM 培养基进行稀释（1 mg/mL），取100 μL 加入上室并干成胶状。细胞汇合达95%时，2.5 g/L 的胰酶消化，小室中加入细胞悬液，下室加入DMEM，培养一短时间后进行固定和染色，并观察与记数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件进行数据分析；用单因素方差进行多组间比较，LSD-t 检验进行组间两两比较；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调HNF1A-AS1 表达对HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMT 的影响

与HOK 细胞相比，HSC-6 细胞中HNF1AAS1表达上调，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1A。与siRNA 组相比，HNF1A-AS1siRNA组细胞内HNF1A-AS1表达降低，HNF1A-AS1siRNA 组细胞增殖活力下调，HSC-6 细胞侵袭数目减少，N-cadherin 表达降低，E-cadherin表达升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见图1B～1G。

图1 下调HNF1A-AS1 表达抑制了HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMTFigure 1 Down-regulation of HNF1A-AS1 expression inhibited the proliferation，invasion and EMT of HSC-6 cells

2.2 HNF1A-AS1 与miR-320d 的靶向关系

HNF1A-AS1与其靶基因miR-320d的结合位点见图2A。与HNF1A-AS1wt+mimics control组 相 比，HNF1A-AS1 wt+miR-320d组HSC-6 细 胞荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与HNF1A-AS1mut+mimics control 组 相比，HNF1A-AS1 mut+miR-320d组HSC-6 细 胞 荧光 素 酶 活 性 无 变 化（P＞0.05），见 图2B。 与siRNA NC 组 相 比，HNF1A-AS1siRNA 组 细 胞内miR-320d表达量上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2C。

图2 HNF1A-AS1 靶向调控miR-320d 表达Figure 2 HNF1A-AS1 targeted miR-320d and regulated its expression

2.3 下调miR-320d 表达对HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMT 的影响

与HOK 细胞相比，HSC-6 细胞中miR-320d表达下调，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3A。与inhibitor NC 组相比，miR-320dinhibitor 组HSC-6细胞内miR-320d表达降低，HSC-6 细胞增殖活力上升，细胞侵袭数目增加，E-cadherin 表达降低，N-cadherin 表达升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见图3B～3G。

图3 下调miR-320d 表达促进了HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMTFigure 3 Down-regulation of miR-320d expression promoted the proliferation，invasion and EMT of HSC-6 cells

2.4 上 调HNF1A-AS1 通 过miR-320d 对HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMT 的影响

与mimics NC 相比，miR-320dmimics 组细胞内miR-320d表达增加，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4A。与pcDNA-3.1（+）组对比，pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1组细胞增殖活力上调，细胞侵袭数目增加，E-cadherin 表达下降，N-cadherin 表达上升，差异有统计学意义（P均＜0.05）；与mimics NC+pcDNA-3.1（+）组相比，miR-320dmimics+pcDNA-3.1（+）组细胞增殖能力下降，细胞侵袭数目减少，E-cadherin 表达上升，N-cadherin 表达下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）；与pcDNA-HNF1AAS1组相比，pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1+miR-320dmimics 组HSC-6 细胞增殖能力下降，细胞侵袭数目减少，E-cadherin 表达上升，N-cadherin表达下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见图4B～4F。

图4 HNF1A-AS1 通过miR-320d 调控HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMTFigure 4 HNF1A-AS1 regulated HSC-6 cell proliferation，invasion and EMT by miR-320d

2.5 miR-320d 与PBX3 的靶向关系

miR-320d与PBX3的结合位点见图5A。与PBX3wt+mimics control 组相比，PBX3wt+miR-320d组HSC-6 细胞荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与PBX3mut+mimics control 组相比，PBX3mut+miR-320d组HSC-6 细胞荧光素酶活性无变化（P＞0.05），见图5B。与inhibitor NC 组相比，miR-320dinhibitor 组PBX3表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图5C。

图5 miR-320d 靶向调控PBX3 表达Figure 5 miR-320d targeted PBX3 and regulated its expression

2.6 下调PBX3 表达对HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMT 的影响

与HOK 细胞相比，PBX3在HSC-6 细胞中的表达水平上调，差异有统计学意义（P＜0.01）见图6A。与siRNA NC 组相比，PBX3siRNA 组HSC-6细胞中PBX3表达降低，HSC-6 细胞增殖活力下调，HSC-6 细胞侵袭数目减少，N-cadherin 表达降低，E-cadherin 表达升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见图6B～6G。

图6 下调PBX3 表达抑制了HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMTFigure 6 Down-regulation of PBX3 expression promoted the proliferation，invasion and EMT of HSC-6 cells

3 讨论

研究表明，长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）参与了肿瘤的增殖和侵袭和EMT等恶性生物学表型。例如LncRNA CDKN2BAS通过miR-153-5p促进肝癌转移［10］；lncRNA SUMO1P3通 过miR-320a促 进 乳 腺 癌 进 展［11］；lncRNAPTENP1通过AKT 和MAPK 抑制乳腺癌增殖［12］。HNF1A-AS1是从HNF1A基因转录的相反链转录得到，在人原发性食管腺癌中首次筛选发现［13］。研究表明HNF1A-AS1能够调节肺腺癌增殖和转移［14］。在肝癌中，HNF1A-AS1调控hsa-miR-30b-5p促进肝癌发展［15］。另外，HNF1A-AS1可能是治疗骨肉瘤的潜在靶点［16］。这些研究表明，HNF1A-AS1可能是一个促癌分子。本研究发现HNF1A-AS1在口腔癌细胞中基因表达高于正常细胞，在体外，沉默HNF1A-AS1 抑制肿瘤细胞生长与转移，这些数据表明，HNF1A-AS1在口腔癌发展过程中起致癌基因的作用。

目前的研究表明，口腔癌中微小RNA（microRNA，miRNA）的差异表达可参与口腔癌的发展。最近的研究表明，miRNAs 的异常表达在口腔癌的发生发展中起着重要作用。如miR-155-5p靶向ZNF703抑制口腔癌细胞转移［17］；miR-205靶向IL-24抑制口腔癌细胞发展［18］。本研究发现HNF1AAS1靶向miR-320d促进口腔癌的发展。miR-320d是miR-320家族的重要成员，已有研究报道miR-320家族在大肠腺瘤中下调；下调miR-320d促进胶质瘤 生 长［19］；miR-320d通 过SOX4抑 制 乳 腺 癌 进展［20］。因miR-320d在口腔癌细胞中的表达情况是未知的，因此首先检测miR-320d在口腔癌和正常口腔细胞中的差异表达，结果发现miR-320d在口腔癌细胞中低表达。后续本实验使用沉默技术探讨了miR-320d的临床意义，发现干扰miR-320d促进了HSC-6 细胞增殖与转移，进一步揭示了miR-320d在口腔癌发展中的作用。大量的研究证实，在胃癌、结肠癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤中miR-144、let7等多种miRNAs 靶向PBX3发挥抗肿瘤作用。本研究发现miR-320d和PBX3具有靶向调控作用。且PBX3在HSC-6 细胞中高表达，干扰PBX3会抑制HSC-6 细胞的增殖、侵袭和EMT，而且HNF1A-AS1能够通过miR-320d调控PBX3的表达。

本研究的结果显示，lncRNA HNF1A-AS1在口腔癌细胞中表达上调，并通过miR-320d/PBX3轴促进HSC-6 细胞增殖、侵袭和EMT。本研究进一步深化了口腔癌进展的机制，为临床应用提供了新的策略。