基于碳纳米管-铂纳米颗粒的H2O2电化学传感器的制备

段鸿梁 袁 旺 李云龙 徐鹤丹 彭雪俐 廖晓玲 张园园

(重庆科技学院 冶金与材料工程学院, 重庆 401331)

0 前 言

骨关节炎是以关节软骨破裂、滑膜炎症、骨赘形成和软骨血管化为主要特征的退行性风湿性疾病，目前仍缺乏有效的预防和治疗措施[1]。近年来，越来越多的研究表明，活性氧(ROS)在骨关节炎的发病机制中起着至关重要的作用[2]。ROS参与了能量代谢和对胁迫、增殖信号的响应等过程，通过氧化还原反应的信号，可以增加细胞增殖和恶性的转化。H2O2是超氧化物歧化酶催化超氧根(O2-)反应的产物之一，是机体内ROS自由基中最稳定的一种。H2O2含有较强的衰老诱导性物质，具有生物活性，可以通过细胞膜的水通道扩散到细胞外。通过检测H2O2的含量，可以了解细胞内ROS的整体水平。

目前，常用的H2O2检测方法包括比色法、荧光法、化学发光法、电子自旋共振法和电化学法等[3]。其中，电化学法具有高灵敏度、高选择性、高准确性、快速响应和易于小型化等优点，在细胞水平分析和药物筛选中得到了越来越多的关注，是目前最常用的H2O2检测方法。

1 电化学H2O2传感器

电化学法检测H2O2的实质是氧的催化还原过程，反应过程如式(1)所示[4-6]：

(1)

由式(1)可知，H2O2传感器的电极材料催化活性越高，电催化反应过程中电子传输速率越快，中间产物(·OHad)含量越少。

电极修饰材料分为有酶型和无酶型[7]。目前，H2O2无酶生物传感器的催化剂已被各种不同形态或组分的仿生酶替代。贵金属及其合金(包括铂、铅、金、钯和铑等)的电催化活性较好，但成本高、合成条件苛刻。金属氧化物的催化剂(Co3O4、MnO2、TiO2等)也可用于检测H2O2[8]。Hao等人将MnO2用于H2O2的快速检测，具有宽线性范围、低检测限等优点，可重复对人血清样品中的葡萄糖含量进行准确检测[9]。

金属氧化物修饰的电极依赖于工作电极较高的氧化电位，这极大地限制了其应用[10-11]。纳米金属和金属氧化物催化剂常遭受附聚和表面状态的损害，使其催化活性、耐久性和灵敏度降低。

针对目前存在的问题，本次研究采用载体材料合成复合纳米结构催化剂。单壁碳纳米管(CNTs)形状柔韧，多孔呈3D网络结构，具有导电性好、比表面积高和电荷迁移率高等优点。铂纳米颗粒(Pt NPs)具有与过氧化物酶类似的内在过氧化物酶活性，相互连接的三维网络提高了Pt NPs的负载能力和催化剂的耐久性，增加了H2O2还原的活性位点[12-14]。本次研究选择CNTs支撑Pt NPs制备H2O2电化学传感器，探究其对H2O2检测灵敏度、检测限、检测范围等性能的影响。

2 实验材料与方法

2.1 实验仪器与试剂

实验仪器：电化学工作站(CHI660E)，玻碳电极(CHI111 Ag/AgCl)，铂丝电极(CHI115)，屏蔽箱(CHI200B),离心机(TG16-WS)，精密电子天平(BSA124S)，真空干燥箱(DZF-6020)，场发射扫描电镜(JSM-780OF)，超声波清洗机(G-1005)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9036A)等。

实验试剂：H2SO4，铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])，KCl，Al2O3，柠檬酸钠(C6H5Na3O7)，NaOH，壳聚糖，氯铂酸(K2PtCl6·6H2O)，CNTs，磷酸二钠氢(Na2HPO4·2H2O)，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)，C2H6O2，C2H6O，谷胱甘肽(C10H17N3O6S)，半胱氨酸(C3H7NO2S)，盐酸多巴胺(C6H11NO2·HCl)，抗坏血酸(C6H8O8)，果糖(C6H12O6)，尿酸(C5H4N4O3)。实验所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水(电阻率>18.2 MΩ·cm)。

2.2 实验方法

2.2.1 Pt-CNTs修饰电极的制备

取适量柠檬酸钠溶于2 mL的乙二醇(EG)中，再加入7.94 mg的CNTs，超声处理后，得到CNTs分散液。向分散液中加入0.5 mL浓度为0.019 4 mol/L的氯铂酸/EG溶液，对其进行超声处理，使铂的前驱体均匀分散在溶液中。用质量分数为5% 的KOH/EG对溶液的pH进行调节，使溶液pH>10。将制备好的溶液置于温度为100 ℃的水浴中反应3 h后，洗涤过滤至溶液中检测不到Cl-。将得到的滤饼置于烘箱中烘干(温度为70 ℃)，得到单壁碳纳米管/铂纳米颗粒(Pt-CNTs)复合材料。使用时，取质量浓度为2 mg/mL的Pt-CNTs二次水分散液与质量分数为1%的壳聚糖溶液以体积1 ∶1超声混合，后续无特殊说明Pt-CNTs均为壳聚糖与Pt-CNTs的混合物。

分别用直径为0.30、0.05 μm的Al2O3粉对玻碳电极(GCE)进行打磨，直到其表面呈现镜面光滑。将打磨后的GCE放入C2H6O和去离子水混合液中，超声处理30 s，得到镜面状表面并依次干燥。将处理好的电极置于在K3[Fe(CN)6]溶液中，采用循环伏安法对其进行电化学表征，设置电位范围为 -0.20～0.60 V，以测试电极性能。当得到典型的循环伏安曲线时，说明电极反应具有可逆性；否则，需要对GCE进行再次打磨，直到符合要求。

将符合要求的GCE用超纯水清洗5 min，N2气流将其吹干后，立即将一定体积的Pt-CNTs滴加到GCE表面；自然风干后即可得到修饰电极(Pt-CNTs/GCE)。实验中，对照组为按照相同实验步骤得到的CNTs/GCE。使用前，需要再用蒸馏水对修饰电极进行浸润、干燥2次，以去除其表面没有固定的纳米材料。

2.2.2 修饰电极的形貌表征

通过场发射扫描电子显微镜(SEM)对电极材料的形貌进行表征，并放大至1 000、3 000倍拍照，通过能谱分析仪(EDS)对修饰电极进行元素表征。

2.2.3 Pt-CNTs/GCE的优化实验

调节PBS缓冲液的pH值，测定Pt-CNTs/GCE对H2O2循环伏安的电流响应，考察pH值对传感器响应电流的影响。

将不同体积的Pt-CNTs滴加到GCE表面，设置修饰体积分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL，以确定Pt-CNTs的最佳修饰体积。在此基础上，对Pt NPs的负载量进行优化，以确定最佳的制备条件。

2.2.4 Pt-CNTs/GCE对H2O2的电催化还原作用

连接电化学工作站，观察Pt-CNTs/GCE加入H2O2前后的循环伏安(CV)行为，采用CV法研究CNTs-Pt/GCE对H2O2的电催化行为。H2O2的浓度依次为0、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mmol/L，扫描速度为100 mV/s。

2.2.5 Pt-CNTs/GCE对H2O2的检测实验

取一定体积PBS缓冲溶液于烧杯中，通N215 min后设置电位。用时间-电流法测量Pt-CNTs/GCE对H2O2稳态电流的响应。待基线电流平稳后，每50 s逐次加入不同摩尔浓度的H2O2，设置其浓度分别为0.02、0.05、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mmol/L，记录响应电流值。按同样的步骤对CNTs/GCE进行操作，比较其响应灵敏度。

2.2.6 Pt-CNTs/GCE抗干扰实验

在炎症环境下，可能存在对电极产生影响的物质，本阶段实验设置H2O2浓度为0.01 mmol/L，干扰物尿酸(UA)、抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)、谷胱甘肽(GSH)、葡萄糖(Glu)浓度均为0.05 mmol/L。

3 实验结果讨论

3.1 修饰电极的形貌表征

通过SEM对修饰电极的形貌和元素进行分析，图1为修饰电极的SEM图。CNTs/GCE的形态结构是相互连接的3D多孔骨架。与CNTs/GCE相比，Pt-CNTs/GCE表面散落有明亮的颗粒物，这可能是Pt NPs黏附在CNTs的骨架上而产生。进一步对CNTs/GCE和Pt-CNTs/GCE进行EDS表征，实验结果如图2所示。CNTs/GCE的主要成分为碳元素，Pt-CNTs/GCE不仅有碳元素还有铂元素。

图1 修饰电极的SEM图

图2 修饰电极的EDS图

3.2 Pt-CNTs-GCE制备条件的优化

3.2.1 溶剂与修饰体积

当以壳聚糖溶液为溶剂的Pt-CNTs修饰GCE后，电流明显增大。当Pt-CNTs修饰体积为2.5 μL时，电流达到最大，电位差约为127 mV。为了探究壳聚糖对Pt-CNTs修饰电极性能的影响，将Pt-CNTs超声分散在二次水中，以二次水为溶剂时的实验结果与壳聚糖一致(见图3)。当Pt-CNTs修饰体积为2.5 μL时，电流最大。这是因为Pt-CNTs的修饰体积过多或过少都不利于电子的传递。当Pt-CNTs的修饰体积为2.5 μL时，电极性能最佳。

图3 修饰体积与溶剂对电流的影响

溶剂不同时，Pt-CNTs在铁氰化钾溶液中的响应如图4所示。当Pt-CNTs以二次水为溶剂修饰电极时，产生电流响应较小，这主要是由于材料在电极表面附着不稳定，易发生脱落。因此，实验中以壳聚糖为溶剂，Pt-CNTs的修饰体积为2.5 μL。

图4 电极在铁氰化钾溶液中的响应

3.2.2 Pt NPs负载量

当Pt NPs与氯铂酸溶液进行水浴加热反应时，可以通过改变氯铂酸浓度的方法来控制Pt NPs的修饰量。Pt NPs的负载量对H2O2电流的影响如图5所示。当Pt NPs的负载量达到20%时，Pt-CNTs/GCE对H2O2的电催化活性最高。综合考虑，当Pt-CNTs 修饰体积为2.5 μL、Pt NPs负载量为20%时，对电极的修饰效果最好。

图5 Pt-CNT负载量对H2O2电流的影响

3.2.3 PBS缓冲液pH值

在相同条件下，调节PBS缓冲液的pH值，对比H2O2在不同pH条件下的电流响应。不同pH条件对H2O2电流的影响如图6所示，其中当pH=6.0时，电流响应最大。

图6 在不同pH值条件对H2O2电流的影响

3.3 Pt-CNTs/GCE对H2O2的电催化还原作用

根据优化的实验条件，连接电化学工作站，在除氧的PBS缓冲液中加入不同浓度的H2O2，H2O2浓度对Pt-CNTs/GCE CV曲线的影响如图7所示。在0.1 V附近的还原峰电流有了明显提高，这说明H2O2能够被Pt-CNTs/GCE催化还原。基于此，确定后续实验的工作电压为0.1 V。

图7 H2O2浓度对Pt-CNTs/GCE CV曲线的影响

3.4 Pt-CNTs/GCE对H2O2的检测

当不同浓度的H2O2加入PBS缓冲液时，传感器的响应时间约为2～3 s，这表明电极和H2O2之间的电子转移十分迅速。随着H2O2浓度的增加，电流台阶不断增强(见图8)。这是由于Pt-CNTs独特的三维纳米结构、高比表面积以及两者结合所带来的协同效应，促进了H2O2在电极表面的电子传递速率，增强了Pt NPs颗粒对H2O2的电催化效果。由图8可知，当H2O2浓度为0.1～1.0 mmol/L时，H2O2浓度与响应电流呈现出良好的线性关系。

图8 Pt-CNTs/GCE对H2O2的检测

3.5 Pt-CNTs/GCE抗干扰性

在实验中，需要测定炎症环境下可能存在的其它物质对所制备电极的影响。研究发现Pt-CNTs/GCE对H2O2表现出明显的电流响应，而其他干扰物对 Pt-CNTs/GCE的影响较小，Pt-CNTs/GCE对干扰物的灵敏性如图9所示。该结果表明制备的 Pt-CNTs/GCE对H2O2具有良好的选择性和优异的抗干扰能力。

图9 Pt-CNTs/GCE对干扰物的灵敏性

3.6 Pt-CNTs/GCE的重现性和稳定性

Pt-CNTs/GCE的重现性和稳定性可通过评估Pt-CNTs/GCE对不同浓度H2O2的电流响应来确定。在相同条件下，制备3支Pt-CNTs/GCE进行电流-时间响应实验。通过计算可知，3支Pt-CNTs/GCE电流响应的相对标准偏差仅为3.5%(见图10a)，这表明制备的传感器具有较高的重现性。

Pt-CNTs/GCE的稳定性通过测试传感器不同时间的电流响应进行评估。通过实验发现，在7 d后，Pt-CNTs/GCE的检测灵敏度仍保持原始值的90%，修饰电极稳定性实验结果如图10b所示。这说明水浴加热合成的Pt-CNTs在电极表面修饰稳定，制备的传感器具有较好的稳定性。

图10 修饰电极重现性、稳定性实验结果

4 结 语

本次研究首先成功制备了Pt-CNTs，然后以壳聚糖为溶剂，用物理滴定的方法成功将其修饰在GCE表面，从而制备了基于单壁碳纳米管-铂纳米复合物的Pt-CNTs/GCE。电化学测试表明Pt-CNTs/GCE对H2O2具有优良的催化性能。制备的Pt-CNTs/GCE可以成功应用于H2O2的检测，在试剂检测、生物传感等方面具有潜在的应用价值。