有氧运动对APP/PS1小鼠脑血流量的影响及其机制

2022-02-04房国梁黎超洋崔凯茵

中国运动医学杂志 2022年11期

房国梁黎超洋崔凯茵

国家体育总局体育科学研究所（北京 100061）

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，其主要临床特征是记忆力逐渐衰退并伴有语言障碍和行为改变；其病理学改变为出现脑内老年斑（senile plaque，SP）[1]、形成神经纤维缠结（neurofbrillary tangles，NFTs）[2]、大脑皮质细胞数量减少[3]以及皮质动脉和小动脉血管淀粉样变性[4]等。该病不仅给患者带来巨大痛苦，而且给社会和家庭带来沉重负担。如何有效预防和延缓AD 已成为不容回避的社会公共健康问题之一，具有深远而重大的研究意义。

研究发现，AD 的病理过程与脑血流量关系密切。脑血管功能障碍常发生在AD 的早期[5，6]，脑灰质内血流量减少可达40%以上[7]。因此，可将脑血流量（cerebral blood flow，CBF）减少作为AD 发生的早期标志[5]。现有研究表明，在AD的病理过程中β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）与脑血流量关系密切，外源性Aβ能降低脑血流量（cerebral blood flow，CBF）[8]，而CBF减少又能诱导Aβ的产生[9]，但是其具体机制尚未完全明确。Nortley 等的研究揭示Aβ能够诱导脑微血管内皮细胞内的NADPH 氧化酶产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 能够激活内皮素-1A（endothelin-1 type A，ETA）受体，释放内皮素1（endothelin 1，ET-1），从而引发脑微血管强烈收缩，减少CBF[10]。

大量研究表明，体育运动，尤其是有氧运动能够有效延缓大脑认知功能衰退，提高大脑学习和记忆功能[11-15]，并且有氧运动能够降低AD模型动物脑内Aβ的水平，提高认知功能[16]。那么有氧运动在延缓和改善AD过程中，是否也能通过减少Aβ诱导产生的ROS，阻断ETA 受体激活，减少ET-1 释放，从而抑制脑微血管收缩，提高CBF？围绕该问题，本研究探讨了8 周有氧运动对AD 模型APP/PS1 小鼠大脑皮质和海马组织血流量的影响及其可能机制，为阐明有氧运动预防和延缓阿尔茨海默症提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 有氧运动小鼠模型的建立

8 月龄雄性APP/PS1 小鼠20 只和8 月龄雄性C57BL/6J 小鼠20 只，每笼2 只。所有小鼠均自由进食和饮水，每天昼夜间隔12 h，环境温度保持在20℃±2℃，相对湿度保持在40%～60%。经过1周的适应性饲养后，APP/PS1 小鼠和C57BL/6J 小鼠均随机分为安静对照组（CG 组）和运动组（EG 组）。其中APP/PS1 小鼠标注为T-CG 组（n=10）和T-EG 组（n=10），C57BL/6J小鼠标注为W-CG组（n=10）和W-EG组（n=10）。在适应性训练阶段，所有小鼠每天跑台训练10 min，速度9 m/min，周一至周五训练。然后，T-EG和W-EG组小鼠进行正式跑台训练，训练周期为8 周。通过动物气体代谢分析系统测定小鼠VO2max，使小鼠训练强度维持在70% VO2max，在8 周时间内跑台速度从12 m/min 增至15 m/min。训练时间从30 min增至60 min，跑台坡度为0o。每周一至周五训练，周六、日休息。T-CG和WCG组小鼠则一直处于安静状态。在训练过程中，密切观察小鼠生活和训练情况。

1.2 Morris水迷宫实验

在第9 周采用Morris 水迷宫实验检测各组小鼠定位航行和空间探索行为能力，判断各组小鼠学习记忆和空间记忆能力。在最初的5 天时间里，小鼠面向池壁，每天从固定一个象限进入水中，记录从入水至找到平台的时间及逃避潜伏期。如果小鼠在2 min 内找不到平台，则由实验者将其引向平台，记录120 s 的潜伏期。每只小鼠每天测试4 次，间隔至少15 min。第6天，移除平台，将小鼠从面向池壁的同一象限放入水中。记录小鼠入水后60 s 内游泳通过平台的次数，评价小鼠的空间记忆能力[16]。

1.3 核磁共振成像

Morris 水迷宫实验结束12 h 内，所有小鼠禁食不禁水。然后采用Discovery MR750 3.0T 系统进行核磁共振成像。每只小鼠用10 %水合氯醛溶液（0.3 mL/ 100 g）腹腔麻醉，并置于俯卧位，然后扫描。系统配备小鼠脑专用线圈，扫描小鼠头部，对采集得到的原始数据利用Functool软件进行图像矫正等预处理，获得CBF参数图，在双侧皮质及海马设置4个感兴趣区，测得CBF平均值，记录数据[17]。

1.4 取材与指标检测

1.4.1 取材

核磁共振成像实验结束后，所有小鼠按照50 mg/kg体重以戊巴比妥钠腹腔麻醉，然后断头取脑，在冰上迅速分离左侧大脑皮质前额叶区和两侧海马组织，将样品保存在液氮中。

1.4.2 ROS检测

各组随机取5只小鼠大脑皮质或海马组织进行连续冷冻切片，厚度20 μm。新鲜切片直接浸入10 μmol /L的DCFH-DA溶液中，37℃孵育20 min，用PBS洗涤3次后封片。荧光显微镜下观察，每张切片选取4个相同位置视野，统计DCFH-DA阳性细胞数量。然后计算ROS相对含量。

1.4.3 Western blot实验

取各组5 只小鼠的大脑皮质或海马组织适量，放入研钵中，加液氮研磨。然后转入1.5 mL EP管中，迅速加入蛋白裂解液裂解。完全裂解后，在4℃离心机中以12000×g 离心10 min。将上清液转入一个新的EP管中，加入蛋白上样缓冲液，在100℃水浴中变性5 min。经SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，室温下用5%脱脂奶粉（溶于TBST 溶液中）封闭1 h。然后用稀释的一抗（ET-1、Aβ42抗体购自Abcam 公司）4℃孵育过夜。第二天，用TBST溶液洗膜3次，每次5 min，去除残留的一抗。然后用稀释的二抗（HRP 标记山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗小鼠IgG均从Beyotime 公司购买）室温孵育1 小时后，用TBST 溶液洗膜4次，每次5 min，去除残留的二抗。最后用ECL 化学发光试剂和X 光片对蛋白质信号进行检测。用Image J专业软件分析不同靶蛋白的灰度值。

1.5 统计学方法

应用SPSS 25.0软件进行数理统计分析。Morris水迷宫实验所得到的潜伏期数据采用三因素重复测量方差分析（时点×小鼠品系×运动方式），其不满足球形度检验，使用Greenhouse Geisser（G-G）对潜伏期结果的自由度进行校正，采用最小显著性差异法（LSD）进行单独效应检验；而小鼠穿越站台次数的统计学方法则采用广义线性模型（GLM），并选择泊松分布簇和对数连接函数进行分析。小鼠CBF、ROS、Aβ42以及ET-1数据则采用双因素方差分析，将运动方式和小鼠品系作为组间主效应，分析二者交互效应。若存在交互作用，则进一步采用LSD法进行单独效应检验；若无交互作用，则进行主效应检验。符合正态分布数据采用平均值± 标准差进行描述统计，其他分布数据则采用中位数和四分位间距进行描述统计。运用Prism GraphPad 8.0软件绘图，界定P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动对APP/PS1 和C57BL/6J 小鼠认知功能的影响

本研究首先通过Morris 水迷宫实验判断有氧运动对APP/PS1及C57BL/6J小鼠学习记忆和空间记忆的影响。表1 为Morris 水迷宫潜伏期数据的描述统计。对Morris 水迷宫潜伏期数据进行三因素重复测量方差分析，结果表明不存在二级交互效应（P=0.282），但小鼠潜伏期存在时点的主效应[F（2.89，104.16）=451.606，偏η2=0.926，P＜0.001]；此外，还存在时点×小鼠品系以及时点×运动方式之间的一级交互效应[时点×小鼠品系F（2.89，104.16）=8.153，偏η2=0.185，P＜0.001；时点×运动方式F（2.89，104.16）=6.206，偏η2=0.147，P＜0.001]。进一步的一级交互效应的单独效应检验结果表明：固定小鼠品系相比较，潜伏期均随着训练天数的递增而缩短（P＜0.05）。另外，小鼠品系之间5天的潜伏期差异都具有统计学意义（P＜0.001），APP/PS1 小鼠的潜伏期均高于C57BL/6J 小鼠；同时，固定运动方式相比较，潜伏期也均随着训练天数的递增而缩短（P＜0.05），并且除第1 天外（P=0.275），其余时间点运动方式之间潜伏期的差异都具有统计学意义（P＜0.01），安静对照组小鼠的潜伏期均高于运动组小鼠。具体的4组间的两两比较见表1：与W-CG组相比，W-EG组潜伏期在第2天开始出现统计学意义上的减少（P＜0.05）；与W-CG 组相比，T-CG 组潜伏期在第1天开始出现统计学意义上的增加（P＜0.05）；与T-CG 组相比，T-EG 组潜伏期在第3天开始出现统计学意义上的减少（P＜0.01）；与W-EG组相比，T-EG 组潜伏期在第1天开始出现统计学意义上的增加（P＜0.01）。以上结果表明，C57BL/6J小鼠学习记忆能力总体高于APP/PS1 小鼠，且无论小鼠是否存在品系差异，8 周有氧运动可提高小鼠学习记忆能力，从而缩短Morris水迷宫的潜伏期。

表1 Morris水迷宫实验各组小鼠潜伏期变化（s）

第6 天进行空间探索实验，各组小鼠运动轨迹图如图1A 所示。表2 是小鼠穿越站台次数的描述统计。广义线性模型—泊松对数线性分析结果表明：小鼠穿越站台次数不存在小鼠品系×运动方式之间的交互效应（交互效应P=0.879），但存在小鼠品系和运动方式的主效应（图1B，小鼠品系P＜0.01；运动方式的主效应P＜0.05）。上述结果说明，无论是否进行了运动干预，APP/PS1 小鼠的空间记忆能力均低于C57BL/6J 小鼠；同时，无论小鼠品系是否有差异，8 周有氧运动均能够改善这两种品系小鼠的空间记忆能力。

图1 各组小鼠穿越站台次数

表2 Morris水迷宫实验各组小鼠穿越站台次数

上述结果说明8 周有氧运动能够提高APP/PS1 及C57BL/6J小鼠学习记忆和空间记忆能力。

2.2 有氧运动对APP/PS1 和C57BL/6J 小鼠脑血流量的影响

本研究通过小动物核磁共振成像系统检测了有氧运动后APP/PS1及C57BL/6J小鼠脑部双侧皮质及海马区血流量（图2A）。如图所示，4 组小鼠大脑皮质CBF（图2B）分别为：W-CG 组1.07 ± 0.08 mL/g/min、WEG组1.28 ± 0.12 mL/g/min、T-CG组0.90 ± 0.06 mL/g/min、T-EG 组1.06 ± 0.08 mL/g/min；海马组织CBF（图2C）分别为：W-CG 组1.28 ± 0.08 mL/g/min、WEG组1.45 ± 0.15 mL/g/min、T-CG组1.09 ± 0.07 mL/g/min、T-EG 组1.23 ± 0.05 mL/g/min。从图2 可以发现，在大脑皮质和海马组织中CBF 均存在小鼠品系的主效应[大脑皮质F（1，36）=49.01，偏η2=0.577，P＜0.001；海马F（1，36）=45.84，偏η2=0.560，P＜0.001]；同时，也存在运动方式的主效应[大脑皮质F（1，36）=45.25，偏η2=0.557，P＜0.001；海马F（1，36）=26.16，偏η2=0.421，P＜0.001]。上述结果表明，APP/PS1 小鼠与野生型C57BL/6J 小鼠相比，其大脑皮质和海马组织中的血流量较低；而无论小鼠品系如何，经过8 周有氧运动，均能够提高APP/PS1以及C57BL/6J小鼠大脑皮质和海马组织的血流量。

图2 大脑皮质和海马组织CBF

2.3 有氧运动对APP/PS1 和C57BL/6J 小鼠大脑皮质和海马组织ET-1含量的影响

有氧运动后APP/PS1和C57BL/6J小鼠大脑皮质和海马组织ET-1 含量见图3A。4 组小鼠大脑皮质ET-1相对含量（图3B）分别为：W-CG 组100.00% ±14.65%、W-EG组63.07% ± 15.96%、T-CG组151.40%± 10.00%、T-EG 组104.35% ± 14.05%；海马组织ET-1 相对含量（图3C）分别为：W-CG 组100% ± 10.49%、W-EG 组53.40% ± 16.41%、T-CG 组176.20% ±11.35%、T-EG 组98.19% ± 13.73%。实验发现，小鼠大脑皮质中的ET-1 相对含量存在小鼠品系和运动方式的主效应[图3B，小鼠品系主效应F（1，16）=56.44，偏η2=0.779，P＜0.001；运动方式主效应F（1，16）=46.33，偏η2=0.743，P＜0.001]，而海马组织中则存在小鼠品系×运动方式之间的交互效应[图3C，交互效应F（1，16）=6.421，偏η2=0.286，P=0.022]。在大脑皮质中（图3B），APP/PS1 小鼠与野生型C57BL/6J 小鼠的ET-1 相对含量差异具有统计学意义，且APP/PS1 小鼠高于C57BL/6J 小鼠；同时，8 周的有氧运动均能够使两种品系小鼠大脑皮质中的ET-1相对含量下降。而海马组织中（图3C），8周有氧运动后，小鼠ET-1相对含量存在运动方式的单独效应（P＜0.001），分别比较W-CG 与W-EG组以及T-CG 与T-EG 组，W-EG 和T-EG 组的ET-1 相对含量下降；同时小鼠ET-1相对含量也存在小鼠品系的单独效应（P＜0.001），W-CG和W-EG组的ET-1相对含量都分别低于T-CG 和T-EG 组。上述结果说明，在大脑皮质和海马组织中，APP/PS1 小鼠的ET-1 比C57BL/6J 野生型小鼠高。而8 周有氧运动能够降低APP/PS1 及C57BL/6J 小鼠大脑皮质和海马组织ET-1含量。

图3 大脑皮质和海马组织ET-1相对含量

2.4 有氧运动对APP/PS1 和C57BL/6J 小鼠大脑皮质和海马组织ROS水平的影响

本研究检测了有氧运动后APP/PS1和C57BL/6J小鼠大脑皮质和海马组织ROS 相对含量。4 组小鼠大脑皮质ROS 相对含量（图4A）分别为：W-CG 组100.00%± 13.40%、W-EG 组62.13% ± 15.20%、T-CG 组159.11% ± 10.96%、T-EG 组96.70% ± 13.13%；海马组织ROS 相对含量（图4B）分别为：W-CG 组100.00%± 9.92%、W-EG 组51.82% ± 20.57%、T-CG 组178.29% ± 12.88%、T-EG 组94.65% ± 15.43%。ROS检测结果表明，小鼠大脑皮质中的ROS 存在运动方式和小鼠品系的主效应[图4A，运动方式主效应F（1，16）=68.49，偏η2=0.811，P＜0.001；小鼠品系主效应F（1，16）=59.77，偏η2=0.789，P＜0.001]；而小鼠海马组织中，则存在小鼠品系×运动方式之间的交互效应[图4B，交互效应F（1，16）=6.61，偏η2=0.292，P=0.021]。无论是否进行运动干预，APP/PS1 小鼠的大脑皮质ROS 相对含量均高于C57BL/6J 小鼠；同时，无论小鼠品系如何，运动均可以降低大脑皮质中ROS相对含量。而在小鼠海马组织的ROS 检验结果中我们可以发现，分别比较W-CG 组与W-EG 以及T-CG 与T-EG 组，W-EG 和TEG组的ROS相对含量均下降，提示存在运动方式的单独效应（P＜0.001）；同时，在海马组织中，W-CG 和WEG 组的ROS 相对含量都分别低于T-CG 和T-EG 组，提示存在小鼠品系的单独效应（P＜0.001）。上述结果表明，在大脑皮质和海马组织中，APP/PS1 小鼠的ROS相对含量比C57BL/6J 野生型小鼠高，但8 周有氧运动可以降低两种小鼠大脑皮质和海马中ROS相对含量。

图4 大脑皮质和海马组织ROS相对含量

2.5 有氧运动对APP/PS1 和C57BL/6J 小鼠大脑皮质和海马组织Aβ水平的影响

有氧运动后APP/PS1和C57BL/6J小鼠大脑皮质和海马组织Aβ42的含量见图5A。经过8周跑台训练后，4组小鼠大脑皮质Aβ42相对含量（图5B）分别为：W-CG组100.00% ± 11.58%、W-EG组52.65% ± 18.88%、TCG 组237.91.11% ± 9.33%、T-EG 组150.38% ±13.72%；海马组织Aβ42相对含量（图5C）分别为：W-CG组100.00% ± 9.93%、W-EG 组51.82% ± 14.76%、TCG 组315.60% ± 8.90% 、T- EG 组198.84% ±12.14%。分析结果表明，小鼠大脑皮质和海马组织中的Aβ42相对含量均存在小鼠品系×运动方式之间的交互效应[图5B、图5C，皮质交互效应F（1，16）=7.00，偏η2=0.305，P=0.018；海马交互效应F（1，16）=20.34，偏η2=0.560，P＜0.001]。随后对皮质和海马中Aβ42进行单独效应检验发现，在两种不同的组织中，都存在运动方式和小鼠品系的单独效应。固定运动方式，分别比较WCG 与T-CG，以及W-EG 与T-EG，发现在大脑皮质和海马组织中T-CG和T-EG组Aβ42的相对含量分别高于W-CG 和W-EG（P＜0.001）；同时，固定小鼠品系，分别比较W-EG 与W-CG 组以及T-EG 与T-CG 组，发现在大脑皮质和海马组织中W-EG 和T-EG 组的Aβ42的相对含量分别低于W-CG和T-CG组（P＜0.001）。上述结果说明，在大脑皮质和海马组织中，APP/PS1小鼠的Aβ42相对含量要比C57BL/6J 野生型小鼠高，而8 周有氧运动能够降低APP/PS1及C57BL/6J小鼠大脑皮质和海马组织Aβ42水平。

图5 大脑皮质和海马组织Aβ42相对含量

3 讨论

大脑是人体最高级神经中枢，新陈代谢十分旺盛。尽管重量仅占体重的2%～3%，却是人体消耗氧气和能量最高的器官，占人体总氧气消耗量的20%以上。因大脑本身不具备储存氧气及能量的功能，需要血液通过高度复杂的脑血管组织向大脑运输氧气、葡萄糖和营养物质，同时在小动脉和微血管处进行物质交换，带走代谢产生的废物。因此，稳定充裕的CBF供应对于维持大脑正常生理功能具有重要作用。近些年来研究发现，AD 的病理过程与CBF 关系密切。AD 最早期的症状就是CBF减少[5，6]，脑灰质内血流量减少可达40%以上[7]。因此可将CBF减少作为AD发生的早期标志[5]。我们在实验中发现，与野生型C57BL/6J小鼠相比，AD模型APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织CBF较低，分别仅为C57BL/6J小鼠CBF的84%和85%。

Aβ的产生是AD最为显著的特征。先前的研究表明，Aβ对血管内皮细胞具有明显的毒性作用，可以影响一氧化氮合酶的活性，减少NO 的生成[18]。而NO 具有扩张血管的作用，因此Aβ能够造成脑血管收缩，降低CBF。CBF 的减少又会促进β-淀粉样蛋白前体蛋白APP 转变为具有毒性作用的Aβ[9]。目前对外源性Aβ的效应研究还主要集中在动脉和小动脉上[8]，而脑内大多数血管阻力位于微血管[19]。Nortley 等的研究结果表明Aβ能够刺激微血管周细胞，引发AD患者及AD模型小鼠脑部微血管收缩，降低CBF，这可能是AD 早期CBF减少的主要原因[10]。微血管周细胞是具有伸缩性的平滑肌细胞样细胞，覆盖在微血管的基底面，其主要功能是参与中枢神经系统微血管收缩性、内皮细胞活性及巨噬细胞活性的调节。研究人员发现，Aβ聚集在AD 患者及AD 模型小鼠脑部微血管周围，诱导周细胞内的NADPH氧化酶产生ROS，ROS能够激活周细胞内皮素-1A（endothelin-1 type A，ETA）受体，释放具有强烈收缩血管功能的活性肽ET-1，从而引发周细胞和微血管的强烈收缩[10]。研究人员通过计算，发现这种收缩足以使CBF减半，这与受AD影响的CBF减少相当。而抑制周细胞引发的微血管收缩能够减少AD 的能量缺乏和神经退行性病变[10]。该项研究为早期预防和治疗AD 开辟了一个全新领域。我们在实验中同样发现，与野生型C57BL/6J小鼠相比，APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织Aβ含量、ROS 水平以及ET-1 的分泌量较高，这可能是造成大脑皮质和海马组织CBF 降低的主要原因。

长期的有氧训练能够改善AD 模型小鼠的空间记忆能力并延缓认知功能衰退进程[20]。经常参加体育运动的老年人AD的发病风险显著降低[21]。此外，参加体育运动的AD 患者脑内β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）水平降低[22]。这为预防和改善AD提供了一种健康可行且有效的策略，但是相关的生物学机制尚不明确。

体育运动能够显著改善脑血管功能，提高CBF。在一项临床试验中，将30名轻度认知障碍患者随机分为两组，进行12个月的干预，一组进行有氧训练，另一组作为对照仅进行伸展训练，两组均进行25～30 分钟的训练，每周3次，12个月后有氧训练组受试者心肺功能和记忆功能得到改善，并且与拉伸组相比，其脑前扣带回皮质CBF增加；此外，个体间的记忆改善程度与前扣带回皮质和邻近前额叶皮质的CBF增加有关[23]。在一项对帕金森病患者的干预试验中发现，经过2 个月的上肢运动后，神经影像学分析显示，与训练前相比，左侧初级运动皮质区、辅助运动皮质区和小脑皮质的CBF明显增加，双侧苍白球与右侧中央盖、右侧后扣带回和左侧感觉运动皮质的功能连接增强[24]。Borror等[25]的研究发现，在急性有氧运动后，CBF 和氧化应激增加，并且促进了脑源性神经营养因子BDNF 的释放，从而解释了认知能力的提高。运动引起CBF增加并能介导血管生成生长因子的局部诱导和全身释放。长期有氧运动可以改变基因表达，增加动脉直径，并从原先存在的微血管处分支生成新的微血管，血管细胞基因表达的改变和微血管的生成增加了血流能力，从而改善血流控制[26]。我们在实验中发现，8 周有氧运动后，APP/PS1和C57BL/6J小鼠学习记忆和空间记忆能力提高，大脑皮质和海马组织血流量增加。分析其原因可能是8周有氧运动降低了Aβ水平，抑制了ROS的产生，从而能够有效抑制周细胞ETA受体的激活，减少ET-1的释放，抑制了毛细血管收缩，提高CBF 和认知水平，从而延缓和改善神经退行性特征。