不同低氧训练模式通过激活小鼠脂肪组织脂噬作用调节脂代谢

李梦影 李灵杰 马春伟 边静 高炳宏

1 上海体育学院运动健康学院（上海 200438）

2 上海体育学院竞技训练学院（上海 200438）

随着社会经济的发展与生活节奏的不断加快，人们不规律的饮食作息和过度的生活压力等各种原因导致机体内脂质蓄积。前人的研究表明，体内脂质堆积通常会提高多种代谢性疾病的发病率，严重威胁现代人的生命与健康[1]。2009 年，Singh 等在肝脏中发现并阐述了自噬对脂滴的选择性降解作用，并引出“脂噬”这一全新的概念[2]。脂噬（Lipophagy）是将细胞内脂滴和胆固醇当作内容物通过自噬体传送到溶酶体，融合后在酸性脂肪酶和水解酶作用下将脂滴分解为甘油和游离脂肪酸的一种细胞内脂肪降解途径[3，4]。Kaushik和Cuervo的后续报道也进一步支持Singh等的研究，揭示了分子伴侣诱导的自噬和巨自噬在清除肝脏脂滴方面的潜力[5]。脂噬最初在肝脏中被发现，之后在其他类型细胞如神经细胞[6]、巨噬细胞[7]和肿瘤细胞[8]中都发现脂噬能够参与调节机体内的脂质代谢[5]。饥饿[9]、运动[10]、寒冷环境[11]等外界刺激可以激活脂噬作用，细胞内脂滴与自噬相关蛋白（autophagy-related gene or protein，Atg）结合激活自噬体的形成，之后自噬体与溶酶体融合降解脂质。当然这也存在着一种反向关系，即细胞内脂质储存的异常也会影响脂噬。脂质可以通过影响信号传导、自噬体膜形成、扩张等环节，从而调控脂噬过程[12]。

低氧训练作为一种新的治疗策略，能通过促进脂质代谢来减控体脂[13]。研究表明长期居住在高海拔地区的人比生活在低海拔地区的人的体脂更低，肥胖相关疾病也更少。低住高练（living-low/training-high，Lo-Hi）是指生活在常氧环境中，在低氧环境下运动的一种训练方式。与其他低氧训练方式相比，低住高练仅需要建造一个训练的低氧环境，而不需要低氧居住环境。这不仅能达到减控体重的目的还能保证受试者训练后疲劳得到正常的恢复[14]。高住低练（living-high/training-low，HiLo）是指居住在低氧环境下，在常氧环境进行运动的一种训练方式。此模式解决了运动负荷和缺氧负荷同时存在的矛盾，但是对机体机能状态的改善效果没有低住高练模式显著[15]。Lu 的研究表明4周的低氧训练能够降低肥胖大鼠的体重、脂肪质量和血脂水平[16]。运动和低氧能激活组织细胞中的脂噬作用，也能有效降低体脂。脂噬的激活能刺激脂滴（lipid droplets，LDs）降解并减少脂肪细胞中的脂质积累[17]。低氧训练减少体脂是否与激活脂肪组织脂噬有关尚未见相关研究证实。因此，本研究主要探究不同低氧训练模式能否通过激活小鼠腹股沟皮下脂肪组织脂噬作用调节小鼠脂代谢，并结合前人研究探讨低氧训练激活脂噬过程中可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组和实验方案

从上海南方模式生物科技股份有限公司购入40只2月龄C57BL/6健康雄性小鼠，在SPF级实验室分笼饲养，自由饮食。动物饲养环境温度为22℃± 2℃，相对湿度50%～70%，12︰12 小时的光暗循环。本实验经上海体育学院动物伦理委员会批准（2017036）。

将小鼠随机分为对照组（control，C组），运动组（exercise，E组），低氧组（hypoxia，H组），低住高练组（LoHi组）和高住低练（HiLo 组）五组，每组8 只。C 组在常氧下生活，不运动。E组、LoHi组和HiLo组小鼠在第1周进行适应性训练，速度从12 m/min 提高到25 m/min，运动时间从15 min/d 增加到了60 min/d。从第2 周开始对E组、H组、LoHi组和HiLo组小鼠进行6周的训练干预，运动方案为：25 m/min，1 h/d，5 d/w；E 组在常氧环境下进行跑台运动；H 组每天8 点～18 点在13.6%（相当于3600 m）低氧浓度下进行低氧暴露；Lo-Hi组在常氧（21%）氧浓度下生活，在13.6%低氧浓度下进行跑台运动；HiLo 组每天8 点～16 点在氧气浓度为13.6%的低氧帐篷下进行低氧暴露，每次低氧暴露结束后进行常氧环境下的跑台运动。低氧组和低氧训练组的低氧干预在低氧帐篷中进行，采用Everest SummitⅡ低氧发生器（可模拟海拔0～8000 m 高度常压低氧环境，美国Hypoxico Inc.公司）。从第1周开始，每周六称量小鼠体重，共7周，体重增长量=第7周体重－第1周体重（g）。

1.2 体成分测试

小鼠的体成分采用动物体成分分析仪（Echo MRI，汇佳生物股份有限公司，中国）测量。首先在体成分测试前称量小鼠体重，对系统进行校准后在软件上输入小鼠编号和体重等信息，之后将小鼠放入适合的Holder内，插入机器上部对应空间，最后测完体成分获得小鼠全身脂肪含量等数据，进而得到体脂比，体脂比=脂肪含量/体重×100%。

1.3 动物取材

小鼠末次训练结束24 h后进行取材，取材前禁食12 h。经腹膜下注射水合氯醛麻醉，麻醉后小鼠内眦静脉丛取血，血液室温静置30 min 后，3000 rpm、22℃离心20 min 后收集血清。血清分装在－80℃保存备用。取小鼠腹股沟脂肪，并使用分析电子天平测量其质量，整个过程在冰上操作。称量后取部分置于脂肪固定液（塞维尔，中国）中固定，用于制备切片；剩余组织迅速置于液氮，整理分类后置于－80℃超低温冰箱备用。

1.4 血清甘油三酯检测

血清甘油三酯（triglyceride，TG）严格按照试剂盒说明书进行检测（南京建成生物工程研究所，中国），在酶标板中分别加入2.5 μl 的蒸馏水、校准品和血清以及250 μl 的工作液，之后在震荡孔板混匀，37℃孵育10 min 波长510 nm，最后用酶标仪（DG5033A，南京华东电子厂，中国）测定各孔吸光度值并按照说明书中的公式计算。

1.5 组织学分析

从C、E、H、LoHi 和HiLo 组中各选择5 只小鼠的脂肪组织进行固定至少12 h 后，从脂肪固定液中取出长、宽、高大致为4 mm的脂肪组织块，修剪组织后置流水中2 h，用酒精脱水后浸蜡包埋，包好的石蜡块修理好切片，使用Leica切片机切片（RM2135，Leica公司，德国），厚度为5 μm，烘干组织后用苏木精和伊红染色，奥林巴斯显微镜拍片，每张片子取3 个视野，保存照片。使用Image J 软件测算每张照片中的细胞平均面积。

1.6 免疫荧光共定位

石蜡包埋及切片的步骤与上述一致，将石蜡切片在烘片机上58℃烘烤1 h 30 min，之后用二甲苯和酒精梯度脱蜡后进行抗原修复，驴血清封闭1小时后，使用LC3（ 1︰200，CST 公司，美国）、LAMP-2（1︰200，proteintech 公司，美国）4℃孵育过夜，次日使用荧光染液（abcam，英国）在室温下孵育90 min，然后用DAPI（上海碧云天生物技术公司，中国）对细胞核染色10 min 后加入2 μl 抗荧光淬灭封片液（上海碧云天生物技术公司，中国）封片。最后用蔡司LSM700 激光共聚焦显微镜观察载玻片，选取合适视野拍照并保存LC3与LAMP-2共定位相关的数据。

1.7 免疫印迹

采用Western blot 方法检测腹股沟皮下脂肪组织的微管相关蛋白1 轻链3 的比值（Microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ/Ⅰ，LC3Ⅱ/Ⅰ）、溶酶体相关2 型蛋白（Lysosome-associated membrane protein type Ⅱ，LAMP-2）、选择性自噬接头蛋白（Sequestosome1，p62）、BECN1 基因编码蛋白（BCL 2 interacting protein，Beclin1）等自噬关键因子的蛋白表达。取适量的脂肪组织剪碎，加入300 μl 含有甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA 裂解液中（PMSF：RIPA=1︰100，上海碧云天生物技术公司，中国），使用高通量组织研磨机（SCIENZ48，宁波新芝生物科技有限公司，中国）裂解组织，在4℃、12000 r/min离心20 min 后取上清，避免吸到脂质，重复两次。用增长型二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（上海碧云天生物技术公司，中国）测定蛋白浓度。样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜 上（Millipore，德国），用5%的脱脂奶粉溶液封闭2小时后加入LC3（1︰1000，CST 公司，美国）、LAMP-2（1︰1000，proteintech公司，美国）、Beclin1（1︰1000，CST公司，美国）、p62（1︰1000，CST 公司，美国）、内参GAPDH（1︰1000，上海碧云天生物技术公司，中国）的抗体4℃孵育过夜，用1×TBST 冲洗3 次，每次8 min，再加入相应的二抗（1︰1000，HRP标记，proteintech 公司，中国），常温孵育1小时后使用全自动化学发光图像分析系统（Tanon5200Muti，上海天能科技有限公司，中国）显影，保存图片。使用Image J软件进行蛋白定量，自噬相关蛋白数据采用GAPDH进行归一化处理。

1.8 统计学分析

所有实验数据均采用SPSS 20.0 统计学软件进行处理，结果以均值±标准差（±s）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同低氧训练模式对小鼠体重、体脂和血清甘油三酯的影响

如图1所示，6周的实验干预后，与对照组相比，运动组、低氧组、低住高练组、高住低练组四组体重增长量都有相应的减少，低住高练组体重增长减少有统计学意义（P＜0.05）；与运动组和低氧组相比，低住高练组和高住低练组的体重增长量也有相应减少，但没有显著变化（P＞0.05）。

图1 6周低氧训练干预后各组小鼠体重增长量、体脂百分比和血清甘油三酯水平比较

小鼠体脂比变化与体重变化有细微差异，与对照组、低氧组和运动组相比，低住高练组与高住低练组的体脂比都有减少的趋势，但是没有显著性差异（P＞0.05），且不同低氧训练模式之间也未见显著差异（P＞0.05）。

低氧组、运动组、低住高练组和高住低练组四组的血清甘油三酯（TG）水平较对照组显著下降（P＜0.01），且低住高练组和高住低练组与运动组和低氧组相比以及不同低氧训练模式之间未见明显变化（P＞0.05）。

2.2 不同低氧训练模式对皮下脂肪细胞形态的影响

如图2所示，6周的实验干预后，与对照组相比，经过运动、低氧以及低氧训练干预后的小鼠皮下脂肪细胞直径明显减少，同一视野下脂肪细胞的数量明显增多；此外，统计分析同一视野下皮下脂肪细胞的平均面积，结果显示，与对照组相比，运动、低氧和低氧训练干预后的小鼠皮下脂肪细胞的平均面积显著减小（P＜0.01）；运动组、低氧组、高住低练组和低住高练组四组之间脂肪细胞平均面积没有明显差异，但低住高练组和高住低练组细胞的平均面积较运动组和低氧组更小；不同低氧训练组平均面积相差较小。

图2 6周低氧训练干预后各组小鼠腹股沟皮下脂肪细胞大小比较（400×）

2.3 不同低氧训练模式对皮下脂肪组织LC3与LAMP-2共定位的影响

如图3所示，与对照组相比，6周的干预之后，出现运动组、低氧组、低住高练组、高住低练组四组皮下脂肪细胞中的橙黄色斑点增多的现象，且6 周的实验干预后，与对照组相比，运动、低氧、低住高练、高住低练组四组的共定位系数都显著提高（P＜0.01，P＜0.05）；同样的，从图3B中可以观察到皮下脂肪细胞的直径明显缩减。此外，运动组的共定位系数显著高于低氧组（P＜0.01）；低住高练组的共定位系数也显著高于低氧组和运动组（P＜0.01）；低住高练组和高住低练组没有明显差异（P＞0.05）。

图3 6周低氧训练干预后各组小鼠腹股沟皮下脂肪组织免疫荧光共定位图（400×）

2.4 不同低氧训练模式对皮下脂肪组织自噬相关蛋白表达的影响

如图4 所示，与对照组相比，运动、低氧、低住高练、高住低练组LC3Ⅱ/Ⅰ、LAMP-2蛋白表达显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。此外，低住高练组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著大于低氧组（P＜0.01），低住高练组LAMP-2的蛋白表达显著高于运动组（P＜0.05）。与对照组相比，低住高练、高住低练组的Beclin1 蛋白表达水平显著提高（P＜0.01）；低住高练组、高住低练组、运动组和低氧组四组之间也未见显著差异。与对照组相比，运动组、低住高练组和高住低练组p62 的蛋白表达显著降低（P＜0.01）；同时，低住高练组的p62蛋白表达显著低于低氧组（P＜0.05）；但不同低氧训练组之间未见显著性差异（P＞0.05）。

图4 6周低氧训练干预后各组小鼠腹股沟皮下脂肪组织脂噬蛋白表达比较

3 讨论

脂肪组织作为“脂肪的储存库”积蓄体内脂质。近些年的研究发现，除了传统的脂肪酶的脂解作用，细胞内的脂噬作用同样能降解细胞内的脂滴[18]。机体在正常的生理状态下存在基础自噬，不同类型的脂肪细胞的自噬水平不同[19，20]。低氧和运动已经被证明可以激活细胞内的脂噬作用，也可以通过增加脂质代谢，减少机体内的脂质储存[21-24]。但低氧训练减控体脂是否与脂噬作用的激活有关尚未可知。

低氧训练可能通过降解脂滴促进小鼠体内的脂质代谢。本研究表明在经过6 周的低氧训练干预后，与低氧组相比，运动组、低住高练组、高住低练组有体重增长减少，体脂百分比减小的趋势，但无明显变化。这可能是因为本实验使用的小鼠体内皮下脂肪组织没有过度积累，所以脂肪代谢之后脂肪减少量较少，差异性难以体现。对脂肪细胞的形态进行观察发现脂肪细胞中央被脂滴占据而呈现空泡状，细胞质贴于四周细胞壁，细胞核扁长位于细胞边缘。在同样视野下，运动组、低氧组、低住高练组和高住低练组的脂肪细胞直径减小，数量增多，低住高练组与高住低练组的平均脂肪细胞面积较运动组和低氧组更小，但这两组的平均脂肪面积差别很小。这也与免疫荧光共定位的结果中脂肪细胞的形态大小变化一致。这提示我们低氧训练确实能减少皮下脂肪细胞内的脂质储存，低住高练和高住低练的干预效果相似。为了进一步确认低氧和运动对脂肪储存的影响促进了脂质代谢，我们测试了血清中TG水平，如图1所示，运动、低氧和低氧训练都能降低血清中的TG水平。上述的形态学、生化指标等结果表明不同低氧训练干预方式促进了小鼠皮下脂肪组织中脂质的分解代谢，减少了细胞中的脂质储存，且低住高练和高住低练的干预效果一致。Gunadi等研究不同训练强度对Wistar大鼠肝脏中与自噬相关的基因表达和蛋白水平的影响，发现高强度训练大鼠血清甘油三酯水平降低更为明显，同时高强度训练组的LC3 和p62 mRNA表达下降，Beclin1、Atg5、LC3的蛋白表达显著增加，这可能意味着中、高强度训练更有助于激活肝脏内的脂噬作用，减少肝脏内的脂质沉积[25]。Song 等的研究发现适度低氧能够降低前脂肪细胞（3T3-L1）中的甘油三酯水平和脂滴大小[26]。低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）信号通路与低氧诱导的自噬密切相关，低氧预适应能够通过激活HIF-1α/Beclin1信号通路激活神经细胞的自噬，从而保护神经，避免缺氧诱导的神经细胞损伤[27]。因此，低氧训练刺激降解脂质，减少脂质储存可能与低氧训练激活了腹股沟皮下脂肪组织的脂噬作用有关。

脂噬过程的调节涉及许多复杂的级联信号，为了确认在不同低氧训练模式干预后的小鼠皮下脂肪中发生了脂噬作用，本研究测试了LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LAMP-2、p62 等自噬关键蛋白表达。在脂噬的起始阶段，腺苷5`-单磷酸（AMP）活化的蛋白激酶（adenosine5`-monophosphate activated protein kinase，AMPK）能够直接调控UNC-51 激酶1（UNC-51 like kinase，ULK1），也可通过抑制雷帕霉素靶蛋白1（mechanistic target of rapamycin，mTOR1）间接激活ULK1，从而导致Atg13、Beclin1 和Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶（vacuolar protein sorting 34，VPS34）底物的磷酸化，促进Beclin1-Vps34-Vps15 复合物的形成，从而诱导脂噬的激活[28]。本研究中不同的低氧训练模式都显著提高了Beclin1的蛋白表达，低氧和运动也有提高Beclin1蛋白表达的趋势，表明低住高练和高住低练干预都激活了脂肪组织的脂噬。Liu等[29]的研究表明定期有氧运动显著增加AMPKα1 的表达以及磷酸化活性水平，上调海马中Beclin1 和LC3 的表达来诱导自噬。这同样证明Beclin1是运动调控细胞自噬的重要调节因子。脂噬被激活后，自噬体膜借助LC3 与脂滴结合后继续扩展延伸形成封闭的自噬小体。因此，LC3 是自噬体的标志分子，LC3 的表达强度及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值与自噬呈正相关[30]。如图4所示，6周的低氧训练干预后，与对照组相比，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LAMP-2 等蛋白表达显著提高。自噬被激活后，细胞内LC3 蛋白的表达水平及其LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化的数量会显著提高[31]。自噬水平升高，LC3Ⅱ/Ⅰ也随之升高，这也与本研究结果一致。前人的研究中对大鼠进行9周的耐力运动训练激活了自噬作用，与对照组相比，附睾白色脂肪组织的LC3Ⅱ和p62以及腹股沟脂肪组织的LC3-Ⅱ和Atg7的表达水平也是显著升高[32]。当然这种LC3 的增加可能不是因为自噬活性的增加，而是由于细胞内自噬体的大量堆积，无法快速降解造成的，所以这就需要结合p62 蛋白的表达水平来评价自噬才更加准确。p62 是细胞自噬的经典底物，其蛋白表达的增多表明自噬对细胞内损伤蛋白或者其他底物的降解能力下降或者是失能[33]。p62将脂滴链接到自噬体后，随溶酶体的降解而减少[34]。本研究结果显示，运动和低氧训练都能降低小鼠皮下脂肪组织p62 蛋白表达，且低氧训练的效果更加显著，这与LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达相符。包裹脂滴的自噬体与溶酶结合后形成自噬溶酶体，在此结合过程中，溶酶体表面蛋白LAMP-2 发挥重要作用。前人的实验结果表明，LAMP-1和LAMP-2双缺陷细胞延迟了溶酶体转运调节因子Ras 相关蛋白7（Ras-related protein，Rab7 ）的募集，并且破坏了自噬体与溶酶体融合，从而破坏了自噬过程[35]。本研究中，经过6 周的干预，运动、低氧和低氧训练组的LAMP-2蛋白表达都显著提高，且低住高练较单纯运动的干预效果更明显。为了再次确认自噬体是否与溶酶体结合，本研究利用LC3 和LAMP-2 进行免疫荧光共定位，如图3 所示，红色荧光代表的是LAMP-2，绿色荧光代表的是LC3，蓝色的斑点则是细胞核的发光颜色。自噬体与溶酶体结合后，自噬体标记蛋白LC3和溶酶体标记蛋白LAMP-2共同定位于自噬溶酶体膜上，绿色荧光与红色荧光叠加后形成黄色的荧光。与对照组相比，6 周的干预之后，出现运动组、低氧组、低住高练组、高住低练组四组皮下脂肪细胞中的橙黄色斑点增多的现象。免疫荧光共定位结果显示，与对照组相比，不同的低氧训练模式干预后LC3 与LAMP-2 荧光共定位系数都显著提高；此外，低住高练组、高住低练组也显著高于运动组、低氧组。LAMP-2是一种单跨溶脂膜蛋白，能保持溶解质稳定并参与自噬[36]，在运动和低氧干预后皮下组织细胞中LAMP-2与LC3蛋白表达升高以及免疫荧光信号增强，LC3和LAMP-2在自噬中发挥重要作用，并且二者增强信号高度重合，均证实腹股沟皮下脂肪细胞发生了脂噬作用。前人的研究表明运动、低氧以及饥饿等刺激时，mTOR 受到抑制，Beclin1 被激活，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化增加，p62表达减少，从而增强自噬活性，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的激活可以上调mTOR从而抑制自噬，而AMPK活化也能抑制mTOR增加自噬[37，38]。Liu等[39]的研究给纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，FNDC5）缺乏的小鼠补充FNDC5，结果显示，外源补充FNDC5 能通过恢复AMPK/mTOR 信号通路，上调LC3Ⅱ的蛋白表达，从而激活自噬，减少肝脏中的脂质累积。这与本研究的结果一致，也提示了脂噬的调控不仅与LC3、Beclin1、p62、LAMP-2 等关键因子的调控有关，还可能与AMPK/mTOR等信号调节因子有关。

综上所述，不同低氧训练方式都能通过激活皮下脂肪组织脂噬作用降解脂滴，调控脂代谢，但具体的调控机制尚未明确，下一步的研究可以从低氧训练激活脂噬作用促进脂代谢入手，进一步探讨此过程的具体调控机制，为低氧训练调控脂代谢提供理论依据。

4 结论

6 周的低氧训练能够通过激活小鼠腹股沟皮下脂肪组织的脂噬作用促进脂质分解代谢，且低住高练和高住低练的干预效果没有明显区别。