质谱SARAMIS软件比对分析功能快速筛查高毒力肺炎克雷伯菌的效果评估*

王惠，温海楠，张宗伟，闫妹姝，张盼，梁悦怡，刘焱超，谢守军

(承德医学院附属医院南区检验科，河北承德 067000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, KP)易引起社区和医院获得性感染，是医院分离率第二的条件致病菌。依据基因组学，可将KP分为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)和经典肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKP)[1-3]。相比于cKP，hvKP毒力更强，临床致死率更高，即使感染后的幸存者也常常伴随着严重的并发症，如失明、脑膜炎及意识障碍等[4]。因此，快速准确地检出hvKP，对于感染的精准防控至关重要。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术不仅在鉴定细菌方面具有快速、准确、低成本的强大优势，而且在探究细菌耐药机制(如区分耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌)及毒力(如鉴定高毒力ST17型B族链球菌[5]、军团菌[6]及艰难梭菌[7]等)方面也具备极大的潜能。但目前尚未有利用MALDI-TOF MS技术检测携带多基因标志物hvKP的相关研究。本课题组前期发现hvKP与cKP菌株相同质荷比(m/z)处蛋白质峰面积(area, A)与强度(intensity, I)的比值(A/I值)存在差异。因此，本实验拟应用Vitek MALDI-TOF MS技术及其科研库SARAMIS软件，通过细菌蛋白质指纹图谱数据的比较，筛选出hvKP与cKP相同质荷比处蛋白质峰有明显差异的A/I值；旨在寻找更快速、准确地区分两组细菌的潜在预测指标，为hvKP的鉴别提供一种快速、全面、高通量的可靠方法。

1 材料和方法

1.1菌株来源 收集承德医学院附属医院2020年11月—2021年10月临床分离的非重复KP菌株共199株，将收集菌株应用Vitek 2.0 Compact全自动微生物分析仪进行初次鉴定，后经Vitek MALDI-TOF MS再次鉴定为KP。纳入标准：满足毒力基因peg-344、iucA和rmpA同时阳性菌株定义为hvKP[1,3]，上述毒力基因阴性或部分阳性的菌株定义为cKP。

1.2主要仪器和试剂 Vitek MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Vitek MALDI-TOF MS仪)、Vitek MS-DS靶板、SARAMIS软件(法国Biomerieux公司)，DNA Engine Peltier热循环仪(美国MJ Research公司)，双稳定时电泳仪(北京六一仪器厂)，C200凝胶成像系统(北京深蓝云生物科技有限公司)；无水乙醇(天津欧博凯化工有限公司)，乙腈(上海麦克林生化科技有限公司)，Vitek MS CHCA Matrix(α-氰基-4-羟基肉桂酸+乙腈)，2×Taq PCR Master mix、100～600 bp DNA marker(北京天根生化科技有限公司)，CelRed核酸染料(河北贝博实验用品有限公司)，PCR引物(上海生工生物有限公司)，大肠埃希菌ATCC 8739(美国菌种保存中心)。

1.3细菌培养 将保存于-80 ℃冰箱的KP菌株取出，置于室温下恢复15 min，采用分区划线法，将标本接种于哥伦比亚血琼脂上，35 ℃普通培养箱温育16～18 h。

1.4PCR扩增及相关毒力基因检测 采用煮沸法提取细菌DNA模板，PCR扩增毒力基因peg-344、iucA及rmpA，PCR引物及反应条件[1]见表1。PCR反应体系：10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×Taq Master mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，超纯水9.5 μL补足25 μL。制备20 g/L琼脂糖凝胶，将5 μL PCR产物和100～600 bp DNA marker加入相应的凝胶孔内，110 V下电泳约50 min，在C200凝胶成像系统下成像，观察检测到的电泳条带大小。

1.5质谱检测及蛋白质图谱获取 保存菌种于室温下复苏后，接种至哥伦比亚血平板，35 ℃温育16～18 h后取单个菌落，参照文献[8]采用甲酸-乙腈蛋白质提取法对菌株进行前处理，后经梅里埃质谱仪检测并使用bioMerieux Vitek MS质谱系统采集蛋白质图谱。每个样本设置3个平行对照靶点，在质荷比为2 000～20 000范围内，以正线性SARAMIS RUO离子模式收集蛋白质图谱，手动模式获取图谱(每张图谱积累100次激光点击形成)。当鉴定结果是KP且鉴定准确率大于90%时，图谱进行保存。用大肠埃希菌ATCC 8739对Vitek MALDI-TOF MS仪器进行校准后，优化质量参数(A、I、信噪比S/N及分辨率R)。

1.6hvKP筛选指标的建立及验证 菌株peg-344、iucA及rmpA毒力基因检测后，随机选取90株KP(47株hvKP和43株cKP)，建立hvKP指标筛选组，按1.5实验步骤进行质谱检测和蛋白质图谱的获取。在SARAMIS系统中，对图谱数据进行自动处理(降噪、平滑基线等)后，进一步放大分析两组菌株蛋白质峰的差异，分别计算上述图谱中不同质荷比处A/I值，筛选出2组细菌相同质荷比处有明显A/I比值差异的蛋白质峰，评估上述蛋白质峰处A/I值的临床诊断效果。采用盲法对另外109株非训练集菌株进行A/I研究指标诊断效能的验证研究，进一步评价研究指标区分hvKP和cKP的临床应用价值。

2 结果

2.1毒力基因检测结果peg-344、rmpA、iucA毒力基因检测结果显示，hvKP(毒力基因全部阳性)占全部菌株的39.7%(79/199)，上述毒力基因全部阴性菌株占全部KP菌株的41.7%(83/199)。见图1。120株cKP中，上述3个基因标记物的2个毒力基因阳性菌株占8.3%(10/120)，包括rmpA+iucA阳性2株，iucA+peg-344阳性2株、rmpA+peg-344阳性6株；单个毒力基因阳性菌株占39.2%(47/120)，rmpA、iucA、peg-344阳性各8、21、18株；毒力基因全部阴性菌株占69.2%(83/120)。

注:M，marker；1、2，rmpA阳性；3、4，iucA阳性；5、6，peg-344阳性。图1 基因扩增产物电泳分析

2.2筛选有明显A/I值差异的蛋白质峰 使用SARAMIS软件对2组菌株蛋白质峰进行放大比对分析，筛选出2组细菌相同质荷比处有明显A/I比值差异的蛋白质峰，见图2。hvKP和cKP 2组细菌的相同质荷比处有明显A/I值差异的蛋白质峰分别位于4 154±5、4 185±5、4 366±5、4 765±5处，hvKP组A/I值分别为49.94±2.94、38.34±5.34、55.56±5.04、42.39±3.47，cKP组A/I值分别为45.79±2.52、44.40±4.72、58.55±5.07、44.64±3.65，hvKP和cKP组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

注：A、B,cKP;C、D,hvKP；a,m/z为4 154处蛋白质峰；b，m/z为4 185处蛋白质峰；c，m/z为4 366处蛋白质峰；d，m/z为4 765处蛋白质峰。图2 肺炎克雷伯菌质谱蛋白质峰

表2 相同质荷比处有明显A/I值差异的蛋白质峰数据分布

2.3ROC曲线比较有统计学差异A/I值对hvKP的诊断价值 利用质荷比4 154±5、4 185±5、4 366±5、4 765±5处A/I值绘制ROC曲线，曲线下面积(AUC)分别为0.892、0.174、0.339、0.326。结果显示区分hvKP有诊断价值的指标为质荷比4 154处蛋白质峰的A/I值，A/I值的临界值为47.87时约登指数最大，诊断效能最高，其AUC为0.892，敏感性、特异性和准确度分别为91.5%、86.0%和88.9%。其余指标诊断价值均较低。见图3。

图3 质荷比为4 154蛋白质峰处A/I值对hvKP诊断价值的ROC曲线

2.4验证研究指标的诊断效能 为了进一步验证研究指标对hvKP的诊断效能，本研究对109株KP(32株hvKP、77株cKP)进行盲测检验。结果显示，质荷比4 154处A/I值≥47.87时区分hvKP与cKP的敏感性、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为87.5%(28/32)、85.7%(66/77)、86.2%(94/109)、71.8%(28/39)和94.3%(66/70)。

3 讨论

hvKP首次报道于我国台湾地区，近年来在全球范围内播散。hvKP易导致迁徙性感染，疾病进展快，感染患者死亡率高[9]。流行病学调查显示，hvKP在西方国家流行率相对较低(<15%)[10]，而在亚洲流行地区KP中hvKP的检出率占22.8%～73.9%[11-12]。本研究收集2020年11月—2021年10月承德医学院附属医院临床分离的199株KP菌株，其中hvKP占39.7%，数据表明hvKP在我院具有较高的流行率。

目前hvKP菌株毒力检测的方法主要有拉丝实验、动物模型试验以及PCR扩增荚膜血清型和毒力基因等。有研究证实基于高黏液表型定义hvKP，其敏感性较差，易漏诊误诊[13]。本研究数据表明(未列出)2个毒力基因阳性菌株中表型为hvKP的菌株占50%(5/10)，单个毒力基因阳性菌株中表型为hvKP的菌株占33.3%(9/27)。因此，以高黏液表型作为区分hvKP与cKP的判定标准并不可靠。采用动物实验可准确区分菌株的毒力强弱，但均存在试验周期长，操作复杂等局限性。随着PCR技术的普及，Parrott等[3]研究发现将rmpA、iucA与peg-344均阳性可作为筛选hvKP的可靠标志。本研究显示cKP中上述3个基因标记物的2个毒力基因阳性菌株占8.3%(10/120)，单个毒力基因阳性菌株占39.2%(47/120)，毒力基因全部阴性菌株占69.2%(83/120)。cKP菌株中部分毒力基因检测阳性的原因可能是关键毒力基因在可移动遗传元件下发生转移，并且不能除外可接合毒力质粒的出现[14]，而毒力质粒与细菌毒力之间的关系，还需进一步验证研究。

质谱在细菌鉴定方面具备快速、准确、重复性好、高通量、低成本等优势，其原理是利用细菌的质谱蛋白质峰进行种属鉴定。hvKP的毒力基因表达为特定蛋白质，可以通过分析质谱科研库中的蛋白质图谱，识别毒力基因相关的特征性质谱蛋白质峰，因而质谱技术在鉴定hvKP毒力基因方面引起关注。近年来，利用质谱特征峰检测KP耐药性的研究颇多，但目前文献报道质谱对于KP毒力表型检测相关研究较少。仅张嵘课题组等采用MALDI-TOF MS对hvKP和cKP进行快速区分，发现非产毒菌株在质荷比3 587、4 745、5 045、5 149、7 168.9和7 280.76处峰强度高于产毒株，其区分hvKP的敏感性和特异性均>90%[15-16]。目前该类研究主要集中在布鲁克公司的Microflex LT质谱仪，而应用梅里埃Vitek MS质谱仪自带的SARAMIS软件的研究较少[17]，国内更是罕见。梅里埃科研库SARAMIS软件可以创建和储存超级谱图或参考谱图；进行聚类分析，创建系统树图用于菌株分型；实现谱图的存储、分析和比较等功能。本研究应用Vitek MALDI-TOF MS技术及其科研库SARAMIS软件的比对分析功能，快速准确鉴别hvKP与cKP。

本研究组前期在临床工作中发现hvKP与cKP组间质荷比4 154±5、4 185±5、4 366±5、4 765±5和5 140±5处蛋白质峰强度存在差异，检索文献未见相关报道。因此针对上述质荷比处蛋白质峰进行了进一步的探索，研究中发现不但菌株的培养时间、培养基的选择和前处理方法的不同会影响质谱的蛋白质峰强度，即使是同一操作者提取的同一菌株蛋白质液的同一蛋白质峰处强度也会存在较大差异。其原因可能是操作者无法保证激光打点处蛋白质量的均一性，即使采用统一的采样路径、激光强度，同一样本的蛋白质峰强度变化幅度也较大。本研究中，预实验结果(未列出)表明以A/I值对实验进行优化可减少差异变化，因此将A/I作为鉴别hvKP可靠的研究指标参数进行研究。在本研究筛选组模型中，hvKP和cKP 2组细菌质荷比为4 154±5、4 185±5、4 366±5、4 765±5处存在明显A/I值差异的蛋白质峰，差异有统计学意义；ROC曲线结果显示仅质荷比4 154处蛋白质峰的A/I值鉴别hvKP具有诊断价值，其敏感性为91.5%，特异性为86.0%，准确度为88.9%。验证组模型中，质荷比4 154处A/I值≥47.87鉴别hvKP的敏感性、特异性和准确度分别为87.5%、85.7%和86.2%。因此，质荷比4 154处A/I值≥47.87为筛选指标具有较高的诊断效能，能较快速、准确地区分hvKP和cKP，并可能成为预测hvKP的潜在新型研究指标。

值得注意的是，以质荷比4 154处蛋白质峰的A/I值≥47.87对菌株进行分类，存在部分菌株鉴定错误的情况。一方面尽管以A/I值作为参数可减弱单一参数变化幅度大的影响，但同样也可能显著降低2组菌株间参数的差异，导致部分菌株无法被准确区分；另一方面由于实验条件有限，未采用动物实验作为鉴定hvKP的金标准，以毒力基因标志物作为标准可能导致部分菌株本身分类错误，造成该指标区分hvKP与cKP出现假阳性或假阴性的情况。因此，对于毒力基因表达的特定蛋白质是否与质荷比4 154处蛋白质峰具有密切的相关性仍需要进一步的探究。

综上，本研究首次成功建立基于MALDI-TOF MS技术准确区分携带多基因标志物hvKP菌株的分类模型，并显示具有较好的诊断效能，对于临床该菌感染的防控具有重要意义。该课题首创以质谱蛋白质峰A/I值作为参数区分hvKP和cKP，为MALDI-TOF MS应用于快速检测hvKP提供新思路。虽然MALDI-TOF MS技术目前并不能替代PCR技术或动物实验等方法准确鉴定hvKP和cKP，但相比于其他检测手段，质谱技术具备操作简单、检测成本低、灵敏度高且重复性较好的优势，有助于提高临床hvKP的检测效率，对于临床感染诊疗意义重大。