丹参酮IIA 通过抑制RIP3/FUNDC1 信号通路减轻LPS 诱导的小鼠肾小管上皮细胞凋亡

张 舒，苏保林，王亮亮，汤水福，陈刚毅

广州中医药大学第一附属医院肾病科，广东 广州 510405

脓毒血症是危重患者发生AKI的主要病因之一，尽管目前诊疗水平不断提高，但脓毒血症AKI在危重患者中的患病率及死亡率仍较高［1］。因此积极探索脓毒血症AKI的发病机制，对寻找有效的诊治方案具有重要的临床意义。

肾小管上皮细胞（RTECs）损伤是AKI发病的重要原因［2,3］，内毒素通过受体相互作用蛋白激酶（RIP）3导致RTECs死亡是AKI的重要机制。一方面，RIP3可介导RTEC发生凋亡性坏死［4-6］；另一方面，它可以通过介导FUN14结构域蛋白1（FUNDC 1）诱导细胞凋亡［7］。FUNDC1是一种线粒体受体蛋白，参与线粒体自噬、细胞凋亡及线粒体Ca2+稳态的调控，近年来研究发现FUNDC1在肾脏疾病中发挥重要作用［7-9］。然而RIP3/FUNDC1信号通路在脓毒血症AKI中的作用，目前尚无报道。

丹参作为临床常用中药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效，丹参酮IIA是从丹参中提取的脂溶性化合物，具有广泛的生理活性，包括抗氧化、抗凋亡、抗炎等［10,11］。近年来研究表明，丹参酮IIA对脂多糖所致的AKI动物具有防治作用［12,13］，但其机制尚不清楚。

本研究分别建立LPS诱导的脓毒血症AKI小鼠模型以及LPS刺激的HK-2细胞凋亡细胞模型，观察丹参酮IIA 对脓毒血症AKI 的保护作用以及其对RIP3/FUNDC1通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 丹参酮IIA，分子式C19H18O3，相对分子质量：294.34（成都植标化纯生物技术有限公司），用DSMO 配制为1g/L 的原液，用时根据需要应用培养基进行稀释。DMEM/F12培养基（CORNING）、二甲基亚砜（DMSO）(Sigma)、脂多糖（L-2880）（Sigma）、RIP3 siRNA（广州锐博生物有限公司）、胎牛血清（FBS）（Hyclone）、Anti-RIP3（Cat No.17563-1-AP）（Proteintech）、Anti-cleaved-caspase3 抗 体（ab2302）（Abcam）、Anti-p-FUNDC 1（Tyr18）（Abgent）、TUNEL试剂盒（瑞士罗氏公司）、Scr、BUN试剂盒（美国博世生物技术有限公司）、糖原PAS染色试剂盒（Solarbio Life Sciences）。

1.1.2 细胞 人源性肾小管上皮细胞株HK-2细胞（广州永诺生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器 超净工作台（Thermo Fisher）；CO2培养箱（Thermo Fisher）；电泳仪（Bio-Rad）；垂直电泳槽和Trans-Blot转印槽（Bio-Rad）；研究级正置荧光显微镜Eclipse Ni-E（Nikon）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物建模 动物实验通过广州永诺生物动物中心伦理审查（编号IACUC-AEWC-F2109012）。30只雄性C57BL/6小鼠饲养于广州永诺生物科技有限公司，10只/组，饲养于SPF级的动物房，小鼠自由进水及进食。造模前全部小鼠均禁食12 h，造模条件如下：对照组予以腹腔注射与LPS等体积的生理盐水；LPS组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS，刺激24 h；LPS+丹参酮IIA 组预先腹腔注射10 mg/kg 丹参酮IIA 处理15 min 再给予10 mg/kg LPS作用24 h。

1.2.2 细胞培养 HK-2细胞置于有10%胎牛血清的培养基（DMEM/F12）、5%CO237 ℃条件下进行培养，每1～2 d换液，细胞生长至密度约90%时即可传代。实验分为5组：空白对照组、LPS组（LPS 10 μg/mL，24 h）、LPS+丹参酮IIA 组（丹参酮IIA 10 mg/L 预处理1 h后，再给予LPS 10 μg/mL 刺激24 h）、LPS+siNC 组（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siNC）、LPS+siRIP3组（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siRIP3）。

1.2.3 TUNEL染色 将约1×104细胞接种于无菌盖玻片上，培养24～48 h，进行相应刺激后，PBS清洗细胞1次，4%多聚甲醛固定细胞30 min，用0.1%Triton X-100透化2 min。按说明书配置TUNEL检测液，将TUNEL检测液滴加至各待检测样本中，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后，荧光显微镜下观察。

1.2.4 siRNA干扰 去除细胞培养基，PBS清洗细胞，加入适量无血清DMEM/F12 培养基。将已混匀的siRNA-Lipo2000混合液培养基中，使含有siRNA的混合液均匀分布于细胞表面，并将培养皿放入5%CO237 ℃培养箱中。6～8 h后观察细胞转染情况及细胞状态，细胞表面出现透亮的圆孔，提示转染成功，即可更换10%FBS完全培养基。

1.2.5 Western blot检测 去除细胞培养基，PBS清洗细胞后，加入细胞裂解液充分裂解细胞，收集上清液，离心后取上清液，根据BCA法检测蛋白浓度，各组样本根据相同质量配齐蛋白，加入Loading buffer后煮沸后加样，进行SDS-PAGE电泳实验。应用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育后显影。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计软件进行统计分析。所有数据进行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布的计量资料，采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用Bonferroni多重比较法。当P＜0.05认为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 丹参酮IIA改善小鼠脓毒血症肾损伤

应用LPS刺激小鼠建立脓毒血症AKI小鼠模型，LPS 刺激小鼠24 h 后，Scr 及BUN 明显高于对照组（P＜0.001，图1C），肾组织PAS染色显示，LPS组小鼠近段RTEC出现空泡变性，管腔狭窄，上皮细胞脱落，基底膜裸露，而对照组没有这些改变（图1A、B）。这些结果表明LPS刺激成功建立了脓毒血症AKI模型，损伤部位主要为近段RTEC。应用丹参酮IIA预处理后（LPS+丹参酮IIA组），小鼠Scr及BUN水平较LPS组下降（P＜0.001），肾组织病理显示，和LPS组比较，近段RTEC空泡变性、上皮细胞脱落、基底膜裸露等损伤改变显著减轻。

图1 各组小鼠肾组织肾脏病理情况（PAS染色）及肾功能水平（Scr、BUN）Fig.1 Renal pathology and serum creatinine and blood urea nitrogen levels in the mice in different groups.A:Representative acid-Schiff-stained kidney sections in the three groups (PAS staining,original magnification: ×200).B:Quantification of tubular injury(10 fields for each kidney section).C:Serum creatinine and blood urea nitrogen levels in the 3 groups.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS.

2.2 丹参酮IIA可抑制小鼠RIP3/FUNDC1信号通路及肾脏凋亡水平

应用Western blot检测肾组织中Cleaved-caspase3的表达水平，结果显示，与对照组相比，LPS组肾组织中Cleaved-caspase3表达上调，丹参酮IIA预处理后（LPS+丹参酮IIA 组），再给予LPS 刺激，小鼠肾组织中Cleaved-caspase3表达水平较LPS组明显下降（图2A、B）。

检测肾组织中RIP3及p18-FUNDC1的表达水平，结果显示LPS刺激后，肾组织中RIP3、p18-FUNDC表达上调，而LPS+丹参酮IIA组，RIP3、p18-FUNDC表达水平较LPS组下降（图2A、B）。

图2 各组小鼠肾组织中p18-FUNDC1、C-caspase3、RIPK3表达水平Fig.2 Expression levels of p18-FUNDC1,cleaved caspase-3 and RIP3 in the kidney of the mice detected by Western blotting.A:Western blots of p18-FUNDC1,C-caspase-3 and RIP3.B:Quantification of p18-FUNDC1,C-caspase-3 and RIP3 protein expressions.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS.

2.3 丹参酮IIA可减轻LPS诱导的HK-2细胞凋亡水平

与对照组相比，LPS刺激HK-2细胞24 h后（LPS组），细胞凋亡水平明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮IIA预处理后，LPS诱导的HK-2细胞（LPS+丹参酮IIA组）凋亡水平明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A、B）。

通过Western blot 检测各组凋亡蛋白Cleavedcaspase3表达水平发现，与对照组相比，LPS刺激后，HK-2细胞Cleaved-caspase3表达增加，丹参酮IIA预处理后，LPS刺激下的HK-2细胞表达Cleaved-caspase3表达较LPS组下降（图4A、B）。

2.4 抑制RIP3/FUNDC1信号通路可减轻HK-2细胞凋亡水平

通过TUNEL检测发现，转染siRIP3后给予LPS刺激（LPS+siRIP3组），细胞凋亡水平明显较LPS组减少（图3A、B）。Westernblot检测各组细胞Cleaved-caspase-3的表达水平发现，LPS+siRIP3 组细胞蛋白Cleavedcaspase-3表达较LPS组明显下调（图4A、B，P＜0.05）。

图3 LPS刺激下不同处理组细胞凋亡水平Fig.3 Apoptosis of HK-2 cells with LPS exposure in different treatment groups.A:TUNEL staining of the cells with different treatments (×200).B:Quantification of TUNEL-positive cells in each group.*P＜0.05 vs control,#P＜0.05 vs LPS.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS.

通过Western blot各组细胞p18-FUNDC1表达水平发现，转染siRIP3后给予LPS刺激（LPS+siRIP3组），而p18-FUNDC1的表达水平下降（P＜0.05）。

2.5 丹参酮IIA可抑制HK-2细胞RIP3/p18-FUNDC1信号通路

通过Western blot检测各组RIP3及p18-FUNDC1的表达水平发现，与对照组相比，LPS组RIP3、p18-FUNDC1表达水平增加。丹参酮IIA预处理下，LPS刺激的HK-2细胞，RIP3、p18-FUNDC1表达水平下调（图4A～C，P＜0.05）。

图4 LPS刺激下不同处理组细胞RIP3、c-caspase3、p18-FUNDC1表达水平Fig.4 Expression of RIP3 and cleaved caspase-3 in HK-2 cells in different groups.A:Western blot of p18-FUNDC1,C-caspase-3 and RIP3 in HK-2 cells with different treatments.B:Quantification of p18-FUNDC1,C-caspase3 and RIP3 protein expressions.C:RIP3 mRNAexpression detected using qRT-PCR in HK-2 cells following different treatments.*P＜0.05 vs control,#P＜0.05 vs LPS.

3 讨论

AKI是脓毒血症最常见并发症之一，脓毒血症AKI在危重患者中具有较高的死亡率，其高死亡率与其发病机制尚不完全明确有关。RTEC损伤是脓毒血症AKI主要的发病基础［14-16］，研究显示，RTEC凋亡在脓毒血症AKI的发病中起重要作用［17-20］。本研究分别用LPS注射小鼠和体外刺激RTEC 构建了体内及体外脓毒血症AKI 模型。在这些模型中，丹参酮IIA 能抑制RIP3/FUNDC1信号通路，减少细胞凋亡，并改善LPS刺激小鼠的肾功能。

RIP3是受体相互作用蛋白家族成员，由N端激酶结构域及C端RIP同型相互作用基序组成，具有磷酸化酶活性，在体内广泛分布，主要表达于肾脏、心脏、脑、脾脏等部位［21-26］。RIP3是凋亡性坏死通路中的关键因子，此外RIP3还可以通过介导FUNDC1参与细胞凋亡的发生。有研究显示脓毒血症AKI患者血、尿中RIP3水平增加，进一步动物研究也发现LPS诱导脓毒血症AKI小鼠，肾组织中RIP3表达增加，并参与脓毒血症AKI中RTEC凋亡的发生，然而机制尚不明确［27］。为验证RIP3是否通过调控FUNDC1介导RTEC凋亡的发生，本研究分别在体内、体外模型中检测RIP3、FUNDC1蛋白的表达情况。

在RIP3/FUNDC1信号通路介导的细胞凋亡途径中，RIP3 通过磷酸化FUNDC1 上的Tyr18 位点，使其失活，进而FUNDC1介导的线粒体自噬被抑制，引起Caspase 依赖的细胞凋亡的发生［7］。因此在RIP3/FUNDC1 信号通路凋亡通路中，RIP3 将介导p18-FUNDC1表达上调。本研究在LPS诱导的小鼠AKI模型及LPS刺激的HK-2细胞中检测RIP3及p18-FUNDC1的表达水平发现，LPS诱导的AKI小鼠模型，肾组织中RIP3、p18-FUNDC1蛋白表达上调；LPS刺激下HK-2细胞中RIP3、p18-FUNDC1 表达同样增加，提示RIP3、FUNDC1可能参与LPS诱导的细胞凋亡损伤过程。在体外进一步沉默RIP3后，LPS介导的RTEC凋亡显著减少，p18-FUNDC1蛋白表达减少，表明RIP3/FUNDC1信号通路可能参与介导RTEC凋亡。

中药单体丹参酮IIA是中药丹参的主要成分，其分子结构及相关药理学功效都较为明确，具有抗凋亡、清除氧自由基、抗炎、抗肿瘤等作用。前期研究观察到，丹参酮IIA具有潜在的肾脏保护效应［28-30］，但目前还没有关于丹参酮IIA对保护脓毒血症AKI的效应及机制研究。本研究中，我们发现丹参酮IIA可减轻LPS诱导的RTEC凋亡损伤。我们首先证实了丹参酮IIA可下调LPS诱导的AKI小鼠肾组织中凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表达；还可减少TUNEL染色的阳性细胞数及下调HK-2细胞中蛋白Cleaved-caspase-3的表达。进一步，我们在体外模型中证实了丹参酮IIA的这一保护效应。

丹参酮IIA是通过什么机制减轻RTEC损伤？我们首次发现丹参酮IIA可下调RIP3的表达水平，并通过抑制RIP3/p18-FUNDC1 信号通路改善RTEC 凋亡水平。这为这种单体中医成分的肾保护提供了一种可能的机制假说。因此，我们提出丹参酮IIA一种新的RTEC保护途径。本研究不足之处，所选丹参酮IIA的剂量单一，对AKI的具体保护机制尚不清楚，故仍需进一步研究。综上，丹参酮IIA可通过抑制RIP3/p18-FUNDC1信号通路来保护LPS诱导的RTEC损伤。丹参酮IIA作为中药丹参的主要活性成分，其现代药理作用丰富，毒副作用小，在临床中具有较好的应用价值。