miR-34a 通过靶向抑制Notch 信号通路减轻糖尿病肾病小鼠的足细胞损伤

王欢岚，刘 红，张燕敏，陈伟栋

武汉市第一医院（武汉市中西医结合医院）肾内科，湖北 武汉 430022

糖尿病肾病（DN）主要是由糖尿病所致慢性肾病，临床表现为蛋白尿、高血压以及水肿等症状［1］。DN的发病机制较为复杂，普遍认为是因高糖环境引起机体糖代谢紊乱、肾脏的血流动力学发生改变和氧化应激、炎症反应过度活化，导致系膜细胞增大肥厚、细胞外基质聚集、肾小管间质纤维化和肾小球硬化，降低肾功能［2,3］。足细胞即为肾小球上皮细胞，其微结构改变在DN蛋白尿产生过程汇中发挥重要作用［4］。微小RNAs（miRNAs）是具有调控基因转录后水平的内源性非编码单链的小分子RNA，可参与细胞增殖、凋亡、代谢、肿瘤发生以及病毒感染等病理过程［5］。研究表明miRNAs也参与DN发病过程［6,7］。有研究通过基因组学分析发现在早期DN中miR-34a的表达显著降低［8］，但其对DN所致足细胞损伤的相关研究尚未有相关报道。Notch信号通路是高度保守的信号通路，参与细胞、组织、器官的发育和分化过程，同时也参与多种病理生理过程［9-11］。有研究证实，辐射照射后大鼠肾组织中miR-34a 能够靶向Notch配体表达降低［12］，提示miR-34a能够靶向Notch调控肾组织的内皮细胞变化。本研究主要探究miR-34a对DN足细胞损伤和凋亡的影响，以期为DN药物研发提供参考意见。

1 材料和方法

1.1 实验材料

MPC5小鼠足细胞系（ATCC），SPF级雄性8周龄C57BL/6J小鼠。动物实验遵循3R原则，通过实验动物的福利伦理审查。

1.2 主要试剂

甘露醇（上海源叶生物科技有限公司），miR-34a mimic及其阴性对照、pcDNA3.1质粒载体和pc-Notch 1过表达质粒载体、agomir-34a和agomir-NC、miR-34a结合位点缺失突变型（Notch 1-mut）及其野生型（Notch 1-wt）的3'UTR的荧光素酶的报告载体（上海吉玛制药技术有限公司），Lipofectamine®2000（Invitrogen），荧光素酶试剂盒（中国台湾亚诺法生技股份有限公司），RNA纯化提取试剂盒和逆转录试剂盒（中国天根生化科技北京有限公司），RT-PCR试剂盒（中国北京庄盟国际生物基因科技有限公司），CCK-8（北京百奥莱博科技有限公司），兔抗鼠caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2抗体（上海康朗生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器

Vilber Fusion Fx7 凝胶成像仪（Vilber Lourmat），LightCycler®96实时定量PCR仪（中国罗氏诊断产品上海有限公司），Aurora 3L-5L 流式细胞仪（Cytek Biosciences），SpectraMax iD3 酶标仪（Molecular Devices），DFM-60D荧光显微镜（中国上海蔡康光学仪器有限公司）。

1.4 体外实验

1.4.1 细胞培养和高糖诱导 使用含有10%胎牛血清、50 U/L γ干扰素的RPMI 1640培养基将MPC5小鼠足细胞置于I 型鼠尾胶原包被的培养瓶中，培养环境为37 ℃、5%CO2培养箱，待细胞融合至90%左右，进行消化传代，然后用不含γ干扰素的完全培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中诱导分化14 d，用于后续实验。将成熟的足细胞在无血清的完全培养基中培养24 h，分为正常糖组、高糖组和高渗透组，正常糖组给予5.3 mmol/L葡萄糖、高糖组给予30 mmol/L葡萄糖、高渗透组给予5.3 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇刺激48 h，然后收集细胞，使用RT-PCR法检测细胞中miR-34a表达水平。

1.4.2 RT-PCR检测 提取细胞总RNA并逆转录生成第一条链cDNA，然后使用RT-PCR法检测miR-34a表达水平，以U6作为内参基因，计算方法使用2-△△Ct。

1.4.3 细胞转染 成熟的足细胞在无血清的完全培养基中培养，待细胞融合度为70%～90%时，参照Lipofectamine®2000 说明书将miR-34a mimic 及其阴性对照转染足细胞，分别记为miR-34a组、miR-NC组，孵育6 h后，更换为含有血清培养基，48 h后，收集细胞，在聚焦显微镜下观察转染情况，RT-PCR验证细胞miR-34a表达水平，明确成功转染后，将pc-Notch 1过表达质粒载体及其空质粒分别转染miR-34a组和miR-NC组足细胞，分别记为miR-34a+Notch 1组、Notch 1组。

1.4.4 荧光素酶实验 采用荧光素酶报告载体来验证miR-34a和Notch 1的关系。软件预测在Notch 1 3'-UTR的190～196 是与miR-34a 结合的位点，并合成该位点的DNA片段（Notch 1 wt）以及含该位点突变体（Notch 1 mut）DNA片段，退火后克隆到双荧光素酶启动子载体pGL3，将miR-34a mimic共转染至足细胞，孵育48 h，依据试剂盒说明书操作比较各组细胞荧光素酶活力值。

1.4.5 CCK-8法检足细胞增殖情况 将转染成功的足细胞以1×105/孔接种至24孔板，均给予高糖（30 mmol/L葡萄糖）刺激，同1.4.1，分别与培养1、2、3、4、5 d时，加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，在波长450 nm处检测光密度A450nm。每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.4.6 流式细胞法检测足细胞凋亡情况 收集高糖刺激48 h足细胞，1000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，加入1×Binding Buffer 300 μL 重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混合均匀，室温避光孵育15 min，上样流式细胞仪，检测细胞凋亡率。

1.4.7 Western blot法检测蛋白表达水平 提取高糖刺激48 h足细胞总蛋白，Bradford蛋白定量，SDS-PAGE分离，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉密封2 h，加入兔抗鼠caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗（1∶500）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，加入HRP标记二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗，显色、定影，使用成像仪子代系统分析蛋白条带灰度值。

1.5 体内实验

1.5.1 糖尿病肾病模型制备 将35只C57BL/6J小鼠参考文献［13］中高脂饮食+链脲佐菌素（一次性腹腔注射100 mg/kg）DN模型制备方法进行2型DN造模，另选15只C57BL/6J小鼠给予正常饮食和腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液，35只小鼠造模不成功5只。动物实验遵循3R原则。

1.5.2 动物分组和干预 将制模成功的DN小鼠随机均分为模型组、miR-34a组，15只/组。miR-34a组和模型组小鼠分别尾静脉注射agomir-34a（80 mg/kg-1·d-1）［14］、agomir-NC（80 mg/kg-1·d-1），连续注射3 d。4周后，麻醉处死小鼠，快速取出肾组织，一部分肾组织固定于甲醛中性溶液，余下肾组织于-20 ℃保存备用，使用RT-PCR检测各组小鼠肾组织miR-34a表达水平。

1.5.3 肾组织HE染色和TUNEL凋亡检测 将已固定肾组织进行常规石蜡包埋、切片，所得切片用于HE染色观察肾组织病理结果变化和TUNEL检测肾组织凋亡情况，详细操作见文献［15］。

1.5.4 肾组织凋亡、Notch信号通路相关蛋白表达水平检测 提取肾组织中总蛋白水平，参照1.4.7中操作方法检测肾组织中caspase-3、caspase-9、Notch 1蛋白水平。

1.6 统计学分析

运用SPSS 22.0软件统计分析数据，定量资料以均数±标准差表示，满足正态分布且方差齐的数据，两组比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖环境对足细胞miR-34a表达水平的影响

在高糖环境诱导下足细胞中miR-34a表达水平低于正常糖诱导下足细胞和高渗透压下作用下的足细胞（P＜0.05，图1）。

图1 miR-34a表达水平Fig.1 Expression level of miR-34a in the podocytes with different treatments.*P＜0.05 vs normal glucose group.

2.2 转染足细胞系验证及miR-34a与Notch1靶向关系验证

miR-34a细胞转染效率为86.75%，Notch 1细胞转染率效为81.69%，miR-34a组足细胞中的miR-34a表达水平高于miR-NC组（P＜0.05），双色荧光素酶实验结果显示Notch 1 wt/miR-34a 组荧光素酶活力值低于Notch 1 wt组（P＜0.05），而Notch 1 mut/miR-34a组荧光素酶活力值和Notch 1 mut/miR-NC组差异无统计意义（P＞0.05）。miR-34a组足细胞中Notch 1表达水平低于miR-NC组（P＜0.05）；Notch 1组足细胞中Notch 1表达水平高于其空质粒组（P＜0.05，图2）。

图2 转染足细胞系验证及miR-34a与Notch 1靶向关系验证Fig.2 Verification of mRNA-target relationship between miR-34a and Notch 1 in transfected podocytes.A:Expression level of miR-34a in transfected podocytes (*P＜0.05 vs miR-NC group).B: Luciferase activity in the podocytes (*P＜0.05 vs Notch 1 wt group).C:Expression level of Notch 1 in the transfected podocytes(*P＜0.05).

2.3 各组足细胞在高糖情况下存活情况比较

高糖组足细胞的A 值与miR-NC 组差异无统计意义（P＞0.05），miR-34a组足细胞的A值高于miR-NC组（P＜0.05），Notch 1组足细胞的A值低于miR-NC组（P＜0.05），miR-34a+Notch 1 组足细胞的A 值低于miR-34a组（P＜0.05，图3）。

图3 各组足细胞在高糖情况下细胞存活曲线Fig.3 Survival curves of the podocytes with different treatments.*P＜0.05 vs miR-NC group;#P＜0.05 vs miR-34a group.

2.4 各组足细胞凋亡情况比较

高糖组足细胞细胞凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平与miR-NC 组差异无统计意义（P＞0.05），miR-34a 组足细胞凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平均低于miR-NC 组（P＜0.05），Notch 1组足细胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平均高于miR-NC 组（P＜0.05），miR-34a+Notch 1 组足细胞凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平均高于miR-34a 组（P＜0.05，图4、5）。

图4 各组足细胞流式凋亡结果Fig.4 Flow cytometry of podocyte apoptosis in each group.

图5 各组足细胞凋亡率和凋亡相关蛋白水平Fig.5 Podocyte apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins in each group.A and C:Levels of Caspase-3,Caspase-9 and Bax/Bcl-2 proteins(1:High glucose group;2:miR-NC group;3:miR-34a group;4:Notch 1 group;5:miR-34a+Notch 1 group);B:Apoptosis rate of podocytes.*P＜0.05 vs miR-NC group;#P＜0.05 vs miR-34a group.

2.5 各组小鼠肾组织病理情况和肾组织miR-34a表达比较

对照组小鼠肾组织细胞结构清晰完整，模型组小鼠肾组织细胞结构呈现出肾小球肿胀、体积增大以及部分伴有纤维化，miR-34a组小鼠的肾组织损伤程度降低（图6）。模型组小鼠肾组织miR-34a表达水平低于对照组（P＜0.05），miR-34a组小鼠的肾组织miR-34a表达水平高于对照组（P＜0.05，图7）。

图6 各组小鼠肾组织HE染色Fig.6 HE staining of renal tissues in each group(Original magnification:×200).

图7 各组小鼠肾组织miR-34a表达Fig.7 Expression of miR-34a in the renal tissues in each group.*P＜0.05 vs control group.

2.6 各组小鼠肾组织凋亡情况

模型组小鼠肾组织凋亡指数和caspase-3、caspase-9、Notch 1 蛋白水平高于对照组（P＜0.05），miR-34a组小鼠肾组织凋亡指数和caspase-3、caspase-9、Notch 1蛋白水平低于模型组（P＜0.05，图8、9）。

图8 各组小鼠肾组织TUNEL染色Fig.8 TUNELstaining of renal tissues in each group(×400).

图9 各组小鼠肾组织凋亡相关蛋白水平Fig.9 Apoptosis index and expressions of apoptosis-related proteins in the renal tissues in each group.A and C:Expressions of caspase-3,caspase-9 and Notch 1 proteins detected by Western blotting(1:Control group;2:model group;3:miR-34a group);B:Apoptosis index of renal tissues.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group.

3 讨论

DN是临床糖尿病患者常见的远期微血管并发症之一，随着病情恶化，可进展为肾功能衰竭，因此也是糖尿病患者致死因素之一［16,17］。DN早期发病具有隐匿特点，导致大部分DN确诊者的肾功损伤程度较大，目前主要采取早发现、早治疗的方式以延缓糖尿病患者肾功能降低进程［18］。目前尚无治疗DN的特效药，积极探索DN发病机制对控制DN病情进展具有重要意义。DN患者临床常见症状为蛋白尿，足细胞有助于维持肾小球滤过屏障的完整性，预防蛋白尿发生［19］。因此，足细胞损伤可能会影响DN发生以及患者预后。

miRNAs具有高度保守性、特异性，参与多种正常生理、病理生理过程［20,21］，本研究结果显示高糖条件诱导下小鼠足细miR-34a表达水平降低，有研究表明高糖刺激能够促使足细胞miR-34a表达下调，诱导足细胞损伤［22］。本研究结果与其趋势相似，说明高糖环境确实可以诱导产生足细胞损伤，并且miR-34a也参与足细胞损伤过程。已有研究表明miR-145-5p也参与高糖诱导足细胞损伤过程，其作用机制可能是靶向作用于Notch信号通路减轻高糖诱导的细胞凋亡［23］。本研究结果显示miR-34a组足细胞中Notch 1表达水平呈降低趋势，此结果与上述前人研究结果相似，说明miR-34a对高糖诱导的足细胞损伤可能与Notch信号通路有关。

本研究通过荧光素酶实验明确miR-34a与Notch 1存在靶向关系，Notch信号通路参与肾脏导管上皮细胞的上皮间质转化过程，Notch 1是Notch信号通路的主要受体之一，该信号通路中的受体及其相应配体结合后，能够使Notch 1的构象发生改变并释放Notch胞内域，从而激活下游基因，调节细胞增殖、分化和凋亡等过程［24,25］。研究表明Notch信号通路在DN中呈明显活化状态，能够对血管生成、胰腺内分泌、外分泌细胞发生等产生影响，发挥介导足细胞损伤、凋亡等作用，还可促进肾小管间质损伤、纤维化，加重DN进展［26,27］。本研究结果显示miR-34a表达水平升高可以提高足细胞存活情况并降低足细胞的凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白水平，而在miR-34a过表达水平基础上过表达Notch 1可以缓解上述指标的趋势，但是单纯Notch 1表达水平升高的足细胞的上述指标趋势呈完全相反状态，说明miR-34a过表达可以降低高糖诱导足细胞损伤和凋亡，可能与直接靶向作用Notch 1有关，而有研究证实，MicroRNA-34a通过负靶向脊髓损伤中的Notch通路来抑制神经元凋亡并减轻小胶质细胞炎症［28］，与本研究结果一致。本研究通过建立动物DN实验发现DN小鼠肾组织存在肾小球肿胀、体积增大以及部分伴有纤维化现象，肾组织miR-34a表达水平降低，并且肾组织凋亡指数和促凋亡蛋白、Notch 1表达水平较正常小鼠升高，而给予miR-34a干预可以部分逆转DN小鼠的肾组织损伤和凋亡情况，还能抑制肾组织Notch 1蛋白水平，说明miR-34a表达水平升高可以通过介导Notch信号通路缓解DN足细胞损伤和凋亡情况。研究证实糖尿病肾病小鼠足细胞损伤与Numb依赖性Notch 1通路激活有关［29］，提示miR-34a可能作为减轻DN足细胞损伤的靶向位点。

综上所述，miR-34a表达升高可以改善DN足细胞损伤和凋亡情况，可能与直接靶向抑制Notch 1表达进而抑制Notch信号通路激活有关。