D-、L-和DL-蛋氨酸的太赫兹时域光谱研究

黄玉青 李 茜 李晓辉 赖小平 文岐业

（1.太赫兹科技应用（广东）有限公司，广东 广州 510000；2.广州中医药大学，广东 广州 510000；3.成都电子科技大学，四川 成都 610000）

0 前言

太赫兹波（Terahertz，THz）是指频率为0.1 THz～10.0 THz、波长为0.03 mm～3.00 mm的电磁辐射，其波段介于微波与红外之间[1]。对比其他频段的电磁波，THz 波光子能量低，穿透深度深；许多中药在THz 的波段中具有特征吸收峰，因此可以直接对中药进行质量评价。

手性分子是在化学结构上呈镜像对称而又不能完全重合的分子[2]，手性药物对映体常具有不同的药理活性及毒性，在体内的代谢情况也不同[3]。当前，药物研究的发展趋势是疗效高、毒副作用小以及用药量少，因此一般要求手性药物以光学纯的单一异构体形式应用于临床。该研究利用太赫兹光谱技术区分蛋氨酸对映异构体，并利用系统指纹定量法建立蛋氨酸浓度差与Pm的线性关系，将其用于定量分析。

1 试验材料

蛋氨酸购于西亚化学科技（山东）有限公司，D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的纯度分别为99.5%、99.5%和99.2%；聚乙烯购于上海阳励机电科技有限公司，分析纯，型号为PE-18180。

2 试验仪器

试验所用仪器如下：1）太赫兹时域光谱仪（CCT-1800型，太赫兹科技应用（广东）有限公司）。这是一种利用脉冲太赫兹（THz）波进行光谱检测的装置，飞秒激光器输出激光脉冲，经过分光片后光速分为2 束，一束作为泵浦光，另一束作为探测光，泵浦光经反射传输到发射天线上，在偏置电压的作用下产生太赫兹波，该太赫兹波经透射或反射等方式接收携带的被测样品的信息，分析得到频域谱、吸收谱、折射率谱以及相位谱等光学物理参数。在测量中能够同时获得太赫兹（THz）脉冲的振幅和相位信息，对时间波形进行傅里叶变换能直接得到样品的吸收系数、折射率等光学参数，具有较高的探测灵敏度和较宽的探测带宽。2）压片机（HY-12 型，天津天光新光学仪器有限公司）。3）压片模具（HF-2A 型，天津天光新光学仪器有限公司）。

3 试验步骤

称取D-蛋氨酸（L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸）粉末，按20%、40%、60%、80%以及100%的质量比例与聚乙烯粉末进行混合，聚乙烯粉提前烘干2 h，使用玛瑙研钵将两者混合均匀后置于压片模具上，压强设置为24 MPa，将其压制成直径13.0 mm、厚度1.1 mm～1.6 mm 的圆形薄片，每个比例制10 个片，共50 片。

仪器预热20 min，因为太赫兹对水分敏感，所以需要提前通一段时间的氮气，以排除样品仓的水分，太赫兹时域光谱仪透射光谱穿过样品，获得参考和样品的时域信号，通过傅里叶变换来获得频域信息，根据Dorney 提出的THz光学参数提取模型，获得样品的吸收系数谱线。

4 结果分析

系统指纹定量法将双定性相似度（SF与SF'）均值Sm称为宏定性相似度（公式（1）），用其整体监测化学指纹数量和分布比例；将双定量相似度（C与P）均值Pm称为宏定量相似度（公式（2）），其可以监测化学指纹的整体含量；通过结合Sm、Pm和α来鉴定中药质量的方法称为系统指纹定量法。据此将中药质量划分为8 级（表1）。规定宏定性相似度大于0.9 为必要条件，任选一组宏定量相似度，将其控制在80%～120%，组内相差不超过10%为合格。系统指纹定量法是对中药系统指纹进行整体定量鉴别，是对中药质量进行整体量化评价的可靠、便捷且有效的方法。该方法找到了中药质量控制的核心技术，适合中国中药的现代化质量控制[4-6]。

表1 中药质量分级

式中：Xi为样品峰面积，描述样品指纹峰积分大小；yi为对照品峰面积，描述对照品指纹峰积分大小；SF为定性相似度，定性描述化学成分数量和分布比例，大峰掩蔽小峰；为比率定性相似度，定性等权描述化学成分数量和比例，大、小峰等权；Sm为宏定性相似度，双定性相似度（SF与）均值；P为定量相似度，定量描述总化学成分宏观含量，大、小峰等权；C为投影含量相似度，定量描述总化学成分宏观含量，大峰掩蔽小峰；Pm为宏定量相似度，双定量相似度（C与P）均值；α为相关系数，描述样品和对照品的差异。

通过太赫兹时域光谱仪测得参考和样品的时域信号，经傅里叶转换得到吸收系数谱。获得D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸在不同浓度（20%、40%、60%、80%以及100%）下的太赫兹吸收系数谱曲线，吸收系数谱除了包括样品自身的信息外，还包括其他无关的信息和噪声，例如点噪声、样品背景及杂散光等，考虑样品的多重反射及高频段噪声带来的影响，对吸收系数谱进行预处理，并截取0.1 THz～4.0 THz 有效频谱数据进行分析。

取末指纹峰为参照物峰，计算各峰统一化相对时间，将其作为横坐标，取积分最大峰为另一参照物峰，计算各峰统一化相对积分，将其作为纵坐标，所作图称为统一化色谱指纹图谱。根据公式（2）计算得到相应的Pm值，见表2。

表2 D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸系统指纹定量法评价结果表

通过分析可以得到D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的宏定量相似度（Pm值）随浓度比例的变化均呈较好的线性关系（R2>95%），可用于对应蛋氨酸的含量分析。其中，D-蛋氨酸的线性公式为y=1.329x+79.39（R2>0.9562），L-蛋氨酸的线性公式为y=1.251x+81.1（R2>0.9860），DL-蛋氨酸的线性公式为y=1.101x+86.95（R2>0.9420）。

从计算结果来看，用太赫兹光谱数据所得的Pm值拟合良好，可用于实际样品含量的测定，为D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的定量分析提供了新的手段。采取相关试验进行进一步验证，试验结果显示，线性公式拟合良好，预测结果与实际结果差异小（RSD<0.2%）。

对D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸THz 吸收系数谱进行对比，取0.1 THz～4.0 THz 的THz 吸收系数谱，结果如图1 所示。由图1 可知，3 个样品的吸收光谱都有明显的特征峰，DL-蛋氨酸在1.9 THz 处有特征峰，L-蛋氨酸在2.9 THz 处有特征峰，D-蛋氨酸在3.1 THz处有特征峰，三者有显著差异。L-蛋氨酸和D-蛋氨酸为手性异构体，它们的分子构造相同且构型互为镜像关系。试验结果显示，蛋氨酸手性异构体的光谱图有微小区别。同时，蛋氨酸手性异构体与它们的外消旋化合物吸收峰的位置和吸收强度都存在明显差别。该结果表明，可以利用太赫兹光谱技术有效地对蛋氨酸手性异构体和它们的外消旋化合物进行鉴别，从而为利用太赫兹技术分辨化合物结构上的微小差异来检测和分析物质提供了新手段。对不含重原子的固体来说，远红外区的吸收主要是分子间的振动，主要包括分子间的相互作用及晶格振动，晶体内部的分子或离子作为一个整体，其在晶格中的相对运动（平动、扭动或摆动）所引起的振动吸收。

图1 同一浓度下D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的对比图

指纹图谱是近年来中药质量控制的热点，2009 年，孙国祥等人[6-7]提出采用系统指纹定量法对中药（材）进行质量评价，其是在对指纹系统宏观定性分析合格的基础上，直接对系统指纹进行整体定量分析，是对系统的宏观量化评价，采取宏观和综合量化的手段控制其真实性、稳定性和一致性的质量控制模式，并结合复杂性科学理论和方法进行控制。太赫兹波对生物大分子具有明显的共振特性，使该技术在食品、药品以及病毒微生物领域具有独特的技术优势。由于生物大分子振动和转动能级大多位于THz 波段，并表现出明显吸收特性，因此生物有机分子间存在的弱相互作用（例如氢键）、大分子的振动、偶极子的旋转和振动跃迁以及晶格低频振动均能响应特征性太赫兹“指纹”波谱，不同的分子（例如单链或双链的 DNA 分子）或同一分子不同的变异形公式（例如蛋白质的不同构形和构象）在太赫兹光谱中显示出不同的吸收率和折射率。

吉特等人[7]利用太赫兹技术鉴定D-青霉胺、L-青霉胺和DL-青霉胺在0.2 THz～1.8 THz 有显著差异，陈涛等人[8]对L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖和DL-阿拉伯糖进行太赫兹光谱研究，三者在0.4 THz～1.8 THz 有显著差异，赵容娇等人[9]对L-福多司坦和DL-福多司坦进行太赫兹研究，两者有显著差异。手性药物的检查逐渐成为药学领域的一个研究热点。对畜禽类来说，其自身不能合成蛋氨酸，须从饲料中摄取氨基酸，DL-蛋氨酸是动物机体内主要的甲基供体，对动物体生理代谢有很强的调节作用。与DL-蛋氨酸相比，日粮补充L-蛋氨酸对肠道氧化还原和发育具有更好的效果，生长性能更高。L-蛋氨酸具有生物学效价高的优势，在生产实践中可以直接减少日粮L-蛋氨酸的添加量，且L-蛋氨酸直接参与蛋白质生物合成，有助于肉鸡生长。

5 结语

利用太赫兹光谱技术获得D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸在0.1 THz～4.0 THz 波段的吸收谱，三者的特征峰存在显著差异，这些差异可进行有效定性鉴别。通过傅里叶转换得到0.1 THz～4.0 THz 太赫兹吸收系数谱，D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸在不同浓度下所对应的Pm值呈线性关系，R2>0.95，线性关系良好，可用于计算单一物质的含量。试验结果表明，太赫兹光谱技术对蛋氨酸对映异构体和浓度差异均具有较高的敏感性，将成为手形药物检测和定量分析的新方法。

后续将对D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸混合样品进行含量测定试验，把纯D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸太赫兹吸收光谱作为标准谱，对它们混合样品的太赫兹吸收光谱进行拟合，将得到D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸在混合样品中的相对含量，太赫兹光谱技术对蛋氨酸对映异构体有较高的敏感性，预估其可以成为一种手形药物检测和定量分析中的新手段。