Hippo通路效应因子YAP/TAZ对肾纤维化影响的研究进展

樊尚珩综述，李 均审校

0 引 言

肾纤维化是肾慢性损伤组织异常修复的结果，也是几乎所有进行性肾病的最终共同途径，其基本特征为肾小管上皮细胞持续受损激活炎症反应，肌成纤维细胞活化分泌大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积于肾间质中致肾小管萎缩及间质毛细血管的丢失，最终肾组织结构的破坏，肾病理性瘢痕组织形成导致肾生物功能不可逆损害[1-2]。其最终结局终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)，除肾移植及透析等肾替代治疗外尚无其他有效的治疗措施，患者承受巨大的经济、心理负担。近年我国慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)发病率、死亡率仍呈上升趋势，因此延缓甚至停止CKD的进展一直是肾病领域热点研究课题[3]。

Hippo信号通路自首次发现以来一直被誉为最核心的控制器官组织生长途径之一[4]。研究表明Hippo通路关键效应因子yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)/带有pdz结合基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)对肾发育、细胞再生、维持内环境稳定、促进组织修复等方面发挥重要调节作用。Hippo通路的扰动可导致肾纤维化的发展。当外界有害因素持续存在，YAP/TAZ活性持续上调，进而通过启动炎症反应、诱导促纤维化因子分泌、ECM过度沉积、细胞异常增殖等机制造成肾损伤[5]。基于YAP/TAZ对肾发展及肾疾病产生的确切影响的相关研究，研究者们通过实验靶向干预Hippo信号通路效应因子防治肾纤维化的研究也获得了一定的成果。本文就现有的研究成果综述YAP/TAZ对肾纤维化产生的影响及新兴的治疗措施，为今后延缓肾纤维化的临床应用提供理论支持。

1 Hippo信号通路的结构

Hippo途径最初在果蝇中的突变体肿瘤抑制因子的筛选中被发现，是一条高度进化保守的信号传导途径。哺乳动物Hippo通路由3个激酶级联组成： 哺乳动物不育20样激酶1/2(mammalian STE20-like 1/2,MST1/2)，大型肿瘤抑制因子1/2(large tumor suppressor kinase 1/2,LAST1/2)，YAP/TAZ，其中TEA结构域家族成员(TEA domain family member,TEAD)是主要的YAP下游转录因子[6-8]。MST1/2和LAST1/2是该途径上游信号的核心组成部分, 而YAP、TAZ是Hippo信号通路下游众多靶基因的转录辅助激活因子, YAP 包含多个与其他蛋白质相互作用的结构域，例如 TEAD 结合结构域、14-3-3 蛋白结合结构域、转录激活结构域和PDZ 结构域[9-10]。

2 YAP/TAZ蛋白的调控

当Hippo途径激活时，该途径主要成分依次发生磷酸化，磷酸化的MST1能直接磷酸化LAST1/2，活化的LAST1/2磷酸化YAP/TAZ中重要的丝氨酸残基S127，LAST1/2对S127的磷酸化是一种主要调节机制，通过与YAP伴侣蛋白14-3-3相互作用，导致YAP/TAZ滞留于细胞质；此外YAP/TAZ可被β-转导蛋白重复序列蛋白泛素化并经历蛋白酶体降解，阻碍YAP由细胞质转移到细胞核；位于细胞质中的YAP 不能与核内 TEAD 结合，YAP转录活性受到抑制，进而细胞增殖和器官生长受到限制。当激酶级联被抑制时，去磷酸化的YAP由细胞质转移至细胞核内积聚；为诱导下游靶基因的表达，移位至核内的YAP本身不与DNA结合，而与TEAD相互作用形成YAP-TEAD复合体从而诱导靶基因表达，如结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，最终执行Hippo通路生物学功能[11-13]。

在癌症和其他疾病的研究中发现，Hippo信号途径的失调导致细胞核内YAP/TAZ增加，YAP/TAZ的核过度积累是其激活的关键因素，也是诱导下游目标基因表达所必需的。有关YAP/TAZ的核质穿梭可分为依赖磷酸化和非依赖磷酸化途径；首先是磷酸化依赖途径：与位点S127磷酸化致YAP/TAZ细胞质滞留相反，YAP丝氨酸残基在位点S128的磷酸化可中断其与14-3-3蛋白的结合，促进YAP核积累。此外，酪氨酸激酶对YAP的磷酸化也可导致YAP核滞留及下游靶基因表达。非磷酸化依赖方式调节YAP活性方面：赖氨酸甲基转移酶Set7 可对YAP的赖氨酸494进行单甲基化使YAP细胞质滞留，而YAP在K342处的单甲基化会诱导YAP核定位。YAP也可以在丝氨酸109处被 O-GlcNAc转移酶 O-GlcNA 酰化，从而破坏其与上游激酶LATS1的相互作用，阻止其磷酸化并激活其转录活性。此外，YAP/TAZ 与其他蛋白质如AMOT蛋白、Micro-RNA的相互作用以及细胞机械力也可诱导 YAP 的核定位和激活，从而增加 TEAD 转录活性[10, 13]。见图1。

图 1 YAP/TAZ细胞内传导途径和致肾纤维化机制

3 YAP/TAZ与肾纤维化

3.1 YAP/TAZ介导机械-生化转导研究发现细胞可通过机械转导系统将微环境刺激信号，如ECM刚度增加，转化为控制细胞行为等多方面的生化信号，YAP/TAZ正是实现机械-生化信号转变的关键枢纽[14]。Hippo 通路可对细胞的生化、物理环境作出反应。河马途径的核心蛋白成分YAP/TAZ作为调节器官大小和肿瘤生长的机械传感器和机械换能器，可感受细胞微环境机械-物理属性如ECM硬度、细胞密度和细胞骨架张力等的变化，将机械信号转化为生化信号，影响下游基因表达从而改变细胞形状和细胞变化方向，促使成纤维细胞向肌成纤维细胞分化[15-16]。此外，YAP/TAZ信号也可以启动细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[17]。Landolt等[18]通过实验表明在肾功能正常状态下，YAP/TAZ参与伤口愈合和组织再生。在组织损伤刺激病理状态下Hippo通路关闭，YAP去磷酸化诱导EMT发生，从而促进纤维化的发展。反之，不断积累的ECM蛋白驱使肾组织硬度和生物力学应力增加，诱导EMT，激活YAP，活化的YAP上调I型、III型和IV型胶原在内的纤维化蛋白的mRNA水平，加速ECM沉积形成正反馈回路，导致成纤维细胞激活[19]。此外，Szeto等[20]研究表示YAP/TAZ不同的定位可调节细胞骨架张力影响肾间质硬化。在柔软、健康的组织里YAP/TAZ定位于细胞质，降低细胞骨架张力，减少硬化的发生；而在损伤的微环境中，YAP/TAZ进入细胞核并激活转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，加速ECM沉积和器官硬化。

3.2YAP/TAZ与其他致纤维化通路串扰

3.2.1 YAP/TAZ与TGF-β/Smad信号通路TGF-β/Smad信号通路是目前公认致肾纤维化的驱动因素，其通过导致肾小管内皮细胞损伤、凋亡，大量炎症细胞因子浸润刺激成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，使ECM合成与降解机制失衡等作用促进肾纤维化[21]。活化的TGF-β与TGF-β受体Ⅱ结合启动细胞内信号转导，激活TGF-β受体Ⅰ，从而激活下游信号通路。SEO等[22]研究表明，敲除上游Sav1基因致YAP/TAZ过表达可诱导TGF-β2和TGF-βRII的表达，且YAP/TAZ可与Smad蛋白协同促进TGF-β信号转导，刺激EMT样表型变化，促进肾纤维化发展。Fujii等[23]实验也证明了Hippo通路与TGF-β/Smad信号通路的联系，通路重要效应因子形成YAP-TEAD-Smad3-p300复合物以促进下游CTGF基因表达增加，促进纤维化发展。此外，抑制YAP基因表达可降低下游致纤维化因子TGF-β和CTGF的表达，显著延缓肾功能下降。肾小管上皮细胞TGF-β和CTGF的分泌同时也可能是维持YAP持续激活的机制[24]。

3.2.2YAP/TAZ与NF-κB信号通路NF-κB是炎症性疾病的重要调节因子，是氧化应激反应重要的炎症因子。当组织持续受损，Toll样受体4 (Toll-like receptors, TLR4)与病原/损伤相关分子模式结合，激活下游 NF-κB 通路并吸引大量炎症细胞参与炎症反应的调节，上调炎症相关基因的表达，诱导炎症因子、趋化因子及活性氧分泌，最终导致肾损伤和肾纤维化[25-26]。Wang等[27]通过实验表明，内皮细胞受损时YAP核表达激活NF-κB通路，并上调了巨噬细胞中促炎细胞因子的表达。此外，Hippo 信号通路作为细胞机械信号传感器，僵硬的基质导致MST1/2 和 LATS1/2 失活，激活的YAP/TAZ移至细胞核中调节炎症反应，增强NF-κB靶基因的诱导从而提高炎症细胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11 和TNF-α的表达。Xu等[28]研究说明在高糖环境下，特异性敲除肾小管上皮细胞MST1/2基因小鼠模型中，YAP可与NF-κB、TNF-α相互刺激，形成正反馈回路促进疾病发展。

3.2.3YAP/TAZ与Rho/Rock信号通路Rho/Rock信号通路参与细胞骨架的重排，且参与细胞环境机械应激调节，促进细胞增殖、凋亡，介导炎症介质、促纤维因子分泌、应力纤维的形成，增加ECM的合成引起肾损伤[29]。Rho因子和肌动蛋白细胞骨架可通过机械转导调控YAP/TAZ。Rho和F-肌动蛋白的细胞骨架是维持YAP/TAZ功能的基础，作用于LATS上游或LATS的F-肌动蛋白组成的应激纤维介导YAP的磷酸化，表明抑制Rho或肌动蛋白细胞骨架轻微的破坏，均可导致YAP/TAZ转录效果急剧下调和核定位[30]。

3.2.4YAP/TAZ与Wnt/β-catenin信号通路Wnt/β-连环蛋白信号激活是多种 CKD 的共同特征。Wnt信号通过与膜受体结合抑制β-catenin的降解，促进Snail1表达参与EMT促进肾纤维化进展[31]。YAP信号的激活可通过增强Wnt/β-catenin的信号以加强EMT标志物如α-SMA、波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白-1的表达，并降低上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达使肾间质纤维化严重程度增加[22]。器官损伤引起的炎症反应形成纤维化微环境，趋使巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞和肥大细胞等炎症细胞浸润。Feng等[31]报道巨噬细胞是早期炎症发展的关键细胞。其中巨噬细胞M2主要分泌TGF-β信号、CTGF、血小板衍生因子，激活肌成纤维细胞等促进肾纤维化。Wnt/β-catenin信号通路上调YAP/TAZ表达加剧成纤维细胞活化和巨噬细胞M2极化促进肾炎症和纤维化。

4 YAP/TAZ与肾纤维化相关疾病的研究

4.1 原发性肾小球疾病膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是原发性肾小球疾病之一，在我国多发于老年患者，且相较于年轻人，老年患者预后很差。M型磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体在MN的敏感性高，是诊断MN的重要指标。有相关临床研究表明在抗PLA2R抗体相关MN患者中，YAP表达和MN患者肾组织PLA2R表达以及与PLA2R相关MN严重程度呈正相关，另外相比于YAP低表达组，YAP高表达组肾功能显著下降[32]。特发性膜性肾病(IMN)是病因不明的MN，补体膜攻击复合物C5b-9介导的足细胞损伤是IMN主要的致病因素。国内研究学者实验提示在IMN患者肾小球中YAP高度表达，C5b-9可激活足细胞YAP信号表达，且沉默YAP表达可显著改善C5b-9诱导的足细胞损伤、凋亡以延缓IMN的发展[33]。

局灶节段性肾小球硬化 (focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是临床预后较差的常见慢性肾小球疾病，足细胞的凋亡、丢失是FSGS重要发病机制之一，因此保护足细胞是治疗FSGS的关键靶点。近年国内外研究表明Hippo/YAP通路在FSGS进展中发挥重要作用，Schwartzman等[34]研究表明YAP的激活可发挥足细胞凋亡的生理拮抗剂作用以维持肾小球滤过屏障的完整性，减轻蛋白尿和肾小球损伤；而YAP基因敲除则直接导致足细胞耗竭。Zhuang等[35]通过研究表明在FSGS患者和阿霉素诱导的FSGS小鼠模型以及原代足细胞培养的肾样本中YAP主要在足细胞的细胞质中大量表达和积累，阿霉素呈时间相关性诱导足细胞中YAP核排斥，而YAP核排斥则与足细胞凋亡呈正相关。与其他有关维替泊芬(verteporfin，VP)可降低YAP/TAZ水平减轻肾纤维化的研究不同，在FSGS小鼠模型中使用VP可诱导YAP从足细胞核向细胞质的易位从而加速FSGS进展，综上YAP活化及核分布是 FSGS进展重要的内源性抗凋亡机制，靶向YAP可能是FSGS治疗的潜在疗法。除了FSGS，足细胞耗竭还与IgA肾病有关，但Hippo/YAP通路能否通过影响足细胞对IgA肾病发挥作用仍需未来更多的探索。

4.2糖尿病肾病糖尿病肾病(diabetic nephropathy ,DN)是ESRD基础上最严重的肾疾病之一。因此，探究糖尿病肾病的发病机制并延缓其进展一直是当代研究热点。DN进展的特征是足细胞密度降低，Haley等[36]在DN患者中证明了YAP在足细胞应激反应中不可或缺，YAP的细胞质易位使细胞骨架重排导致足细胞足突消失、随后脱离肾小球，且这种变化在Ⅲ、Ⅳ级病例中更为明显。Chen等[37]研究发现在糖尿病环境中EGFR依赖性YAP蛋白上调，当糖尿病小鼠肾近端小管上皮细胞暴露于高糖环境中可激活EGFR-PI3K-Akt-CREB信号通路从而介导YAP基因表达、YAP核转位且增加YAP- TEAD结合，导致TEAD 依赖性促纤维化基因，如CTGF、双调蛋白基因表达上调，形成YAP-TEAD-CTGF通路加剧肾损害；相反，在肾上皮细胞系中沉默EGFR、Akt或CREB的药理学或基因表达会阻断高糖诱导的YAP蛋白表达和磷酸化以延缓DN进展。此外，Xu等[28]通过研究表明，在糖尿病肾近端小管上皮细胞中Rho/ROCK信号的激活介导YAP激活，过度产生的ECM使肾间质刚度增强，进一步激活Rho/ROCK信号通路，形成高血糖-Rho/ROCK-YAP-ECM-基质刚度-Rho/ROCK的恶性循环，推动糖尿病肾病纤维化的进展[38]。

5 Hippo信号通路靶向治疗抗肾纤维化

5.1 Hippo通路抑制剂YAP/TAZ已成为治疗慢性肾病的一个有吸引力的靶点。越来越多的实验研究表明Hippo通路在纤维化及上皮性癌变的分子细胞机制中有着许多共同的特征，提示在纤维化的治疗中我们是否可以应用与抗肿瘤中相似的靶向治疗[18]。中断YAP-TEADS结合是目前新的药理干预。VP长期以来一直在临床上通过光动力疗法用于治疗年龄相关性黄斑变性，也是抗肿瘤的有效光敏剂[39]。基于目前的研究证据：VP可破坏YAP-TEAD复合物，抑制YAP/TAZ活性，因此VP可能被重新定位为一种抗肾纤维化的潜在药物。Wang等[40]的联合实验研究表明， VP通过上调14-3-3α来抑制YAP的功能，阻止YAP迁移到细胞核，并通过蛋白酶体靶向降解YAP蛋白。Jin等[41]通过向小鼠腹腔注射VP发现其可调控TGF-β/Smad信号通路、降低Smad磷酸化；降低肌成纤维细胞的活化、增殖和迁移；降低UUO小鼠中YAP/TAZ水平；有效抑制YAP-Tead结合；Liu等[42]研究表明VP可对UUO诱导的肾间质损伤、炎症反应、细胞外基质沉积及纤维化起保护作用。VP也可诱导构象变化，干扰YAP与其他蛋白相互作用的能力传导下游信号CTGF的表达。此外，Ren等[43]使用G 蛋白偶联受体凝血因子II受体样1拮抗剂可选择性阻断内皮细胞中YAP的促纤维化活性、减少EMT以减轻肾纤维化。Li等[44]研究发现对UUO小鼠使用法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)激动剂EDP-305可呈剂量依赖性地减少巨噬细胞浸润及间质纤维化，且降低人肾细胞中TGF-β诱导的YAP核激活，说明抑制YAP可能是FXR激动剂的一种新的抗纤维化机制。更深入地了解河马通路上游调节因子和下游效应因子以及相关抑制剂作用靶点对我们在探索延缓肾纤维化治疗方法中至关重要。

5.2其他药材提取物长久以来中药通过多靶点、多途径治疗肾纤维化一直具有独特的优势和应用前景。除以上抑制剂外，使用中药调控Hippo通路以抗肾纤维化的研究也获得了越来越多的关注和实验证明。目前研究者们已通过实验证明使用单味中药提取物如雷公藤甲素[45]、桑枝多糖[46]、姜黄素[47]等以及中药复方如黄芪三七合剂[48]、虫草益肾方[49]可抑制Hippo信号通路关键因子YAP/TAZ核表达从而延缓肾纤维化发展。因此，积极开展中药有效组分及配伍与Hippo通路之间相互作用以及药物作用于通路靶点的研究,对延缓慢性肾病发展并指导中医药治疗肾纤维化的相关研究具有重要科学意义。

6 结 语

Hippo信号通路在肾损伤修复中发挥重要作用，其过度激活可引起细胞增殖、黏附及转移，介导器官大小及肿瘤发生。近年研究表明Hippo信号通路在肾纤维化中起重要作用。此通路调控肾纤维化中重要的病理过程--ECM的合成、沉积，且受细胞基质硬度的相互作用加剧肾纤维化发展；与多条公认的致纤维化通路如TGF-β通路、NF-κB信号通路等相互作用；且抑制该通路重要效应因子YAP/TAZ可显著减轻肾纤维化。尽管已有研究显示药物干预Hippo信号通路抗肾纤维化且取得了一定的研究成果，但目前的研究大多限于细胞、动物实验，并未真正应用于临床治疗中；同时该通路各级效应因子相互作用复杂，应通过更多实验证明该通路除YAP/TAZ其他因子对肾疾病的影响，且通过进一步实验了解抑制剂干预潜在靶点之间的关联。总之，继续探索河马途径对原发、继发性肾疾病的正常生理机制和致病机制以及对相关靶点干预可为我们在临床工作中延缓肾纤维化发展提供新的治疗靶标和策略。