高强度紫外线对周丛生物膜除磷以及光合作用的影响研究

张 润，施天宇，景连东

(西南民族大学化学与环境学院，四川 成都 610041)

被称为“世界屋脊”的青藏高原的生态环境问题一直是我国环境保护关注的重点.近年来，由于人为散养牲畜，牲畜的排泄物造成青藏高原局部地区水污染.研究发现牲畜粪便的随意排放造成青藏高原多个牧区饮用水水源水质部分指标超出规定限值[1]，这些牲畜粪便中含有大量的磷等营养盐元素[2]，大量的营养盐进入水体会引起一系列的重大环境问题，比如水体富营养化、水华等等对生态环境有负面影响，进一步影响人的生产生活.

生物方法是净化自然水体的方法之一，有环境友好、经济成本低，且去除效率高的优点.周丛生物膜是常用的生物方法，其是生态系统中的重要组成部分，在净化水体方面有良好的前景.周丛生物膜是附着在水下表面的水生生态系统中很常见的一种微生物聚集体，包含藻类、细菌、真菌、原生动物等微生物以及它们的次生代谢产物等[3].近年来，周丛生物膜被广泛用于研究各种污水治理，其中周丛生物膜对营养盐的去除表现出优异的效果.本团队研究发现附着于玄武岩纤维上的周丛生物膜对总磷的去除效率可达95%左右[4].周丛生物膜除磷主要靠吸附作用、吸收降解作用以及共沉淀作用[5].磷作为重要的营养物质而被水体中的微生物吸收利用，而其对营养物质磷的利用水平取决于磷在水体的形态.总体而言，根据磷在天然水体中的物理性质、化学形态的不同，可以将总磷分为总溶解态磷(TDP)和颗粒态磷(PP)，溶解态磷(TDP)又分为可溶活性态磷(SRP)和可溶非活性态磷(SUP).不是所有形态的磷都可以被水中的微生物很好的利用，比如颗粒态磷，这部分磷主要以有机物颗粒形式结合，难以被生物所直接利用[6].因此研究周丛生物膜对不同形态磷的去除比单一估计总磷的去除更能反映周丛生物膜对磷的去除效果.同时周丛生物膜对磷的去除效果与周丛生物膜生长发育密切相关.光照、温度、营养水平等环境因子都会影响周丛生物膜的生长进而对其除磷效果产生影响[7].由于青藏高原的特殊环境，该地区紫外强度普遍偏高[8]，是周丛生物膜生长发育的重要环境因子，但是本团队已在高海拔地区发现了周丛生物膜的存在，若将周丛生物膜运用于高强度紫外地区，则还需进一步研究高强度的紫外对周丛生物膜生长的影响.

紫外线共分为三类:短波紫外线UVC(100～280 nm)、中波紫外线UVB(280～320 nm)、长波紫外线UVA(320～400 nm)，其中到达地面的为90%UVA和10%UVB，虽然UVB 占比不高，但其对微生物的损害强于UVA[9].紫外辐射能量高，对微生物的生长、发育和生理代谢会产生负面影响，但微生物也发展出一套适应系统来抵抗一定的紫外线强度.高强度的紫外辐射明显抑制藻类光合作用，对光系统II 造成一定损伤，降低其光合色素含量，使光合作用过程受阻，藻类会产生更多的屏蔽色素比如类黄酮、胞素氨基酸等等减少UVR 对其的损伤[10].过多的活性氧自由基(ROS)的产生是UVR 对微生物重要毒性机制.增加UVR 强度会破坏细胞内ROS 平衡，造成细胞膜脂质过氧化，进而破坏细胞结构，微生物会通过提高抗氧化酶活性比如超氧化歧化酶、过氧化氢酶等等以清除过多的ROS，提高机体的抗氧化防御能力，抵抗UVR辐射引起的损伤[11].周丛生物膜对营养盐的净化效果与其生长发育密切，相关较高的紫外辐射强度可能会通过影响周丛生物膜的生长发育而进一步影响其净化水质的效率.

因此，为了推进周丛生物膜运用于高紫外线地区的水污染治理，本实验(1)模拟高原地区的UVA、UVB 强度研究周丛生物膜对粪便污水中各种磷形态的去除效果，(2)研究UVA、UVB 对周丛生物膜光合作用的影响，为该区域微生物资源研究和周丛生物膜技术应用于青藏高原水环境修复提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 周丛生物膜的培养

从西南民族大学专家楼人工湖(30.569 345 N，103.967 118 E)中采集了约100 g 新鲜的周丛生物膜样本.这些周丛生物膜样品通过滤网进行分散和过滤.在滤液中加入5 L WC 培养基，于培养箱中培养(光/暗:12/12 h，25 ℃±1 ℃)，以获得足够的周丛生物膜菌种[7].将菌种均匀倒入3 个透明有机玻璃盒(23 cm×9 cm×7 cm)中，每个盒子底部放入8 片载玻片(7.5 cm×2.5 cm×0.2 cm)，加入约500 mL WC培养基，于光照培养箱中培养40 d(光/暗:12/12 h，25 ℃±1 ℃)，获得成熟的周丛生物膜.

1.2 畜源污水的制备

将采自于红原县的牦牛粪便混合均匀，平均分成3 份，每份约300 g，放入5 000 mL的湖水.倒入6 个有机玻璃盒中，每个盒子约800 mL.

1.3 污水除磷净化实验

基于上述培养的周从生物膜和制备的畜源性污水，开展了3 种类型、7 种处理的除磷净化实验，并设置对照实验1 组.具体为，仅紫外照射处理:UVA ＋污水(UVA 组)、UVB ＋污水(UVB 组)；仅生物处理:周丛生物膜＋污水(P 组)；紫外与生物联合处理:UVA＋周丛生物膜＋污水(UVA ＋P 组)、UVB ＋周丛生物膜＋污水(UVB ＋P 组)；对照组(CK 组):仅污水.于光照培养箱中进行实验(光/暗:12/12 h，25 ℃±1 ℃).在培养容器上方用紫外灯管进行照射处理，用两根T5 8 W 的UV-B(312 nm)灯管(上海季光厂制造)和两根18 W 的UVA 灯管(飞利浦)作为UVA、UVB 光源.通过调整紫外灯与液面距离，来调整UVA、UVB 的最终强度分别为3 W/m2，60 W/m2(紫外辐照计，北京师范大学光电仪器厂制造)，每天照射12 h.于实验开始后在0、3、6、12、24 h 取水样供后续相关指标测定，实验结束后，替换新配置的牛粪污水，开展新一轮的实验，共计开展三轮.

1.4 测定指标及方法

1.4.1 磷的测定

针对0、3、6、12、24 h 取得的水样测定总磷(TP)、总溶解性磷(TDP)、溶解反应活性磷(SRP)、颗粒磷(PP)的含量.磷的测定方法为钼酸铵分光光度法，详细步骤见《GB 11893-89》.水样采集后，一部分用0.45 μm纤维滤膜过滤；另一部分水样直接用于测定.TP 为未过滤的水样经过硫酸钾消解后的磷；TDP 为过滤后经过消解磷；SRP 为过滤膜后未经消解测定；颗粒磷(PP)的含量为TP 与TDP 的差值.

1.4.2 叶绿素荧光参数的测定

通过叶绿素荧光参数变化来表征周丛生物膜内光合作用的变化.采用叶绿素荧光仪(AquaPen-P fluorometer，Photon Systems Instruments，捷克)测定参数，于每天照射UVA、UVB 前和照射12 h 后测量.暗反应30 min 后测量快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)，通过曲线可以测量许多光合参数，如初始荧光(F0)、光系统II(PSII)最大光化学量子产量(Fv/Fm)、PSⅡ的潜在光化学活性(Fv/F0)、PSII 反应中心的光吸收通量(ABS/RC)；耗散能量通量(DIo/RC)；最大电子传递通量(ETo/RC)；最大能量通量(TRo/RC)等等.

1.5 数据处理

所有实验重复三次.结果均表示为平均值±标准差(SD).使用SPSS 软件27.0 版本进行数据分析，采用单因素ANOVA 方差分析检验评估各组的差异，P＜0.05 被认为具有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 UV 对周丛生物膜除磷的影响

如表1 所示，三轮循环后，P、UVA ＋P、UVB ＋P组24 h 后对TP、TDP、SRP、PP 的去除效率均在70%以上，统计结果显示P值均大于0.05，各组对不同磷形态的去除没有显著差异.也就是说，高强度UVA、UVB 照射下周丛生物膜对不同磷形态仍有较高的去除效率.而去除效率与本团队之前相比较低，这可能与周丛生物膜的载体有关，附着于载玻片的周丛生物膜生物量以及物种丰富度均低于附着于玄武岩纤维的周丛生物膜[4].

表1 P、UVA ＋P、UVB ＋P 对TP、TDP、SRP、PP 的三轮净化平均去除效率Table 1 Average removal efficiency of TP，TDP，SRP and PP in P，UVA ＋P and UVB ＋P groups

图1 为各组在24 h 内对不同磷形态的去除效果.各组对TP、TDP、SRP 的去除变化趋势基本相同，无周丛生物膜的组(CK、UVA、UVB)中各种磷的浓度没有降低，而有周丛生物膜的组中各种磷浓度均在下降.而颗粒磷的浓度在各组均有下降的变化趋势.如图1(a)为各组对TP 的去除效果.单独的UVA、UVB 照射对TP 的去除没有促进作用.UVA、UVB 照射12 h 后，UVA ＋P、UVB ＋P 组就对TP 有很高的去除效率，P、UVA ＋P、UVB ＋P 组三轮循环中净化12 h 的去除效率分别为(65.08 ± 8.3)%、(67.56 ± 8.13)%、(67.36 ±4.79)%，统计结果显示P值均大于0.05，三组的去除效果无明显差异，这表明UVA、UVB 照射对周丛生物膜除磷功能没有抑制作用，值得注意的是，在第一轮净化实验中，UV 照射3 h 后，UVA ＋P 对总磷的去除效率明显高于P、UVB ＋P，其值TP 的浓度分别从0.93 降低至0.33、0.53、0.56，这可能由于初始的高强度UVA 照射提高的周丛生物膜的生理代谢活动，增强其对营养盐的利用.净化24 h 后，P 组TP 的浓度从1.11、1.11、1.06 mg/L 降至0.16、0.27、0.32 mg/L，平均净化效率为(77.33 ±6.60)%.UVA＋P 组TP 浓度经过24 h 净化后降至0.16、0.22、0.28 mg/L，平均净化效率为(79.67 ±5.31)%，UVB ＋P组TP 浓度降至为0.16、0.29、0.26，平均净化效率为(78.67 ±5.25)%.P、UVA ＋P、UVB ＋P 三组对TP 的去除效率无明显差别，上述结果表明，在高强度UVA、UVB 照射下周丛生物膜依旧可以对TP 有较高的去除效率.

总溶解性磷(TDP)定义为通过一定孔径滤膜的滤液所含的磷，可溶性的磷容易被水生生物吸收和利用.溶解性活性磷(SRP)定义是TDP 的主要形态部分，正磷酸盐是SRP 的主要形式，有高度的生物利用性.如图1(b)和1(c)所示，三轮循环过程中P、UVA＋P、UVB ＋P 三组对TDP、SRP 的浓度持续下降，在每轮循环中经过12 h UVA、UVB 照射后P、UVA ＋P、UVB ＋P 三组对TDP、SRP 的去除效率没有显著差异(P＞0.05)，说明高强度的UVA、UVB 照射不会降低周丛生物膜对TDP 与SRP 的去除效率.且高强度UVA、UVB 照射后周丛生物膜对TDP、SRP 对去除效率仍然高于某些单一藻类的去除效率，UVA ＋P、UVB ＋P 组对TDP 与SRP 的去除效率分别为(80.33 ±7.04)%、(86.67 ±8.73)% 和(79.67 ± 7.59)%、(86.00 ±9.42)%；邢丽贞等人[12]研究发现在24 h 后，颤藻、小球藻等微藻对溶液中正磷酸盐的去除低于50%，周丛生物膜的去除效率远高于这些单一微藻.

颗粒态磷(PP)为水体中不能通过0.45 μm 微孔滤膜的磷形态，这部分磷主要以有机物颗粒形式结合，难以被生物所直接利用，并受水体微环境和物化性质的影响很大.如图1d 所示，各组PP 在三轮循环中浓度都在下降.仅有UVA、UVB 照射PP 的浓度也在下降，这应该与颗粒磷的沉降作用有关，P、UVA ＋P、UVB ＋P 组对PP 的净化去除效率分别为(85.33 ±10.87)%、(79.00 ±3.56)%和(76.33 ±8.96)%，统计分析显示P值均大于0.05，无显著差异.净化24 h后，有周丛生物膜处理的体系比无周丛生物膜的体系更清澈，这可能表明在有周丛生物膜净化的组中，对PP 的去除不仅仅是依靠PP 本身的沉降作用，还可能与周丛生物膜对PP 的吸附作用有关，周丛生物膜因其复杂的微形态结构特征和丰富的胞外聚合物对PP提供更多的吸附位点，从而使体系更加清澈[5].

图1 各组对TP、TDP、SRP、PP 的去除效果Fig.1 Removal performance of TP，TDP，SRP and PP in different groups

上述结果表明，UVA、UVB 对周丛生物膜净化牛粪污水中不同形态的磷没有明显抑制或促进作用.前人研究表明高强度的UVB 会抑制周丛生物膜的生长发育[13]，本研究结果发现净化24 h 后P、UVA ＋P、UVB ＋P 对不同形态的磷的净化效率无明显差别，且对牛粪污水中的各形态磷的净化效果均较好，这可能与周丛生物膜本身能抵抗UVA、UVB 有关.周丛生物膜除磷的机制主要分为吸收与吸附.磷是周丛生物膜中微生物的生长代谢需要营养元素，吸收作用是周丛生物膜除磷的重要原理之一[14]，周丛生物膜将污水中的磷吸收，促进自身生长发育，周丛生物膜的优势菌群为变形菌，该菌群中含有大量的聚磷菌，这种菌群在好氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内[15].其次，周从生物膜是一个复杂的微生态系统，具有丰富多样的微生物物种组成和复杂的微结构形态特征，吸附作用也是周丛生物膜除磷的重要机理[16].

2.2 UV 对周丛生物膜光合作用的影响

近年来，叶绿素荧光参数普遍用来反应环境胁迫因子对周丛生物膜光合作用的影响[17].初始荧光F0是PSII 反应中也全部开放时的荧光产量，用于表征PSII 反应中心的基本状态，该值的大小通常与叶绿素的含量有关，逆境胁迫下该值的变化通常与PSII 反应中心受到不可逆的破坏或可逆的失活有关[18].如图2a 所示，对照组周丛生物膜F0值相对稳定维持在10 000至12 000 之间.P ＋UVA 组周丛生物膜F0值经过2 d 的照射与对照无明显差别(P＝0.707)，值得注意的是，第3 d，12 h UVA 照射后，F0值显著增加，从9 805增加至12 965，照射后12 h，降低值11 334，与对照组接近，这表明在第3 d 的UVA 照射，周丛生物膜PSII 反应中心受到破坏，光合潜力降低.UVB 对周丛生物膜的胁迫强于UVA，在3 d 的UVB 照射过程中，P ＋UVB 组的周丛生物膜F0值出现明显波动.12 h UVB 照射后，F0值显著增加(P＝0.004)，12 h 后降低，接近对照组.具体来说，第一次12 h UVB 照射后从11 964 增加至14 155，12 h 后恢复至10 330，接近对照组的周丛生物膜，第二次又增加至13 519，12 h后恢复至10 600，第三次增加至14 996，12 h 后恢复至11 580.上述结果表明UVB 显著破坏周丛生物膜PSII 反应中心，光合潜力降低，但UVB 对周丛生物膜PSII 的破坏不是不可逆的，对于高强度UVB 胁迫，周丛生物膜仍能有一定恢复能力.

Fv/Fm 为光系统II 的最大光化学效率，与光合效率密切相关，其值的高低可反应周丛生物膜所受到的胁迫程度和周丛生物膜的光合效率[18].如图2b 所示，未照射紫外线的周丛生物膜的Fv/Fm 值没有明显变化，照射UVA、UVB 的周丛生物膜Fv/Fm 值出现明显的波动，总体来看UVB 对周从生物膜光合效率的胁迫强于UVA.UVA 照射12 h，周丛生物膜的值从0.54 降低为0.44，光合效率降低了20%，经过12 h的恢复，其值又上升为0.55，后续Fv/Fm 值变化趋势相同，在照射UVA 2 d 后的周丛生物膜Fv/Fm 值与对照组无明显差别(P＝0.41).值得注意的是在第3 d UVA 照射12 h 后，周丛生物膜Fv/Fm 值明显下降，从0.55 降低为0.35，经过12 h 恢复至0.41.上述结果表明，高强度UVA 照射后周丛生物膜的光合效率会被抑制，但其仍有一定的恢复能力.UVB 照射后的周丛生物膜Fv/Fm 值变化趋势与UVA 照射下的相同，但其照射后的值与12 h 恢复后的值都显著低于对照组与UVA ＋周丛生物膜组(P＜0.05).UVB 照射12 h后，Fv/Fm 值从0.54 降低为0.28，光合效率降低了49%，恢复12 h 后，其值又上升为0.49，在后面两天的照射与恢复，Fv/Fm 值都出现相似的下降与上升，但总体Fv/Fm 的值低于对照与UVA 组.经过3 d 的照射，对照组P、UVA ＋P、UVB ＋P 组的Fv/Fm 值分别为0.47、0.41、0.38.由此可见UVA、UVB 照射后会显著抑制周丛生物膜光合作用光系统II 的光化学效率，从而抑制光合作用，且UVB 对周从生物膜光合作用的抑制作用强于UVA.但周丛生物膜仍有一定的恢复能力，且其值虽然被抑制但仍能保留有一定光合作用.

如图2(c)～2(f)所示为UVA、UVB 对周丛生物膜PSII 反应中心的比能通量的影响.比能通量的变化是光合生物抵抗外部压力的一种方式.如图2 所示，通过PSII 反应中心比能通量(RC)来评估UVA、UVB对周丛生物膜光合系统、电子转移和光能转换的影响[19].ABS/RC 指反应中心的光吸收通量(用于PSII天线叶绿素)；DIo/RC 是每个PSII 反应中心的耗散能量通量；ETo/RC 指每个PSII 反应中心的最大电子传递通量；TRo/RC 每个反应中心捕获的最大能量通量.如图2 所示，UVB 对周丛生物膜光合系统的影响强于UVA.暴露于UVA 的周丛生物膜的比能通量变化与对照组无明显差别.而暴露于UVB 的周丛生物膜四种比能通量与对照组的变化明显不同.每轮12 h UVB 照射后，周丛生物膜的光吸收通量(ABS/RC)显著增加，而电子传递通量(ETo/RC)与电子捕获通量(TRo/RC)的值明显低于对照组，这表明UVB 会抑制周丛生物膜PSII 的电子转移过程.耗散能量通量(DIo/RC)值的增加表明周丛生物膜吸收的过多的能量最终能被耗散.

图2 UVA、UVB 对周丛生物膜叶绿素荧光参数的影响Fig.2 Effects of UVA and UVB on chlorophyll fluorescence parameters of periphyton

综上，暴露于UVA、UVB 时，周丛生物膜的光合作用会受到抑制，但仍保留一定光合作用能力，比能通量变化受到影响，具体表现为PSII 反应中心活性以及数量受到负面影响，最大光化学效率降低，光吸收通量增加，电子传递与电子捕获通量降低，耗散能量通量增加，且对于上述变化UVB 对周丛生物膜的影响强于UVA.而在无UVA、UVB 照射时，周丛生物膜光合作用都有一定的恢复，其原因可能是通过增强自身代谢，从而吸收更多营养盐磷元素.因此，在净化24 h后，UVA ＋P、UVB ＋P 组的净化效率与P 组无明显差别.

3 结论

暴露于高强度UVA、UVB 下周丛生物膜对污水中的TP、TDP、SRP、PP 有较高的去除效率，均高于70%，与未照射UVR 的周丛生物膜去除效率没有显著差异，表明高强度UVA、UVB 不会抑制周丛生物膜的除磷功能.本研究发现UVA、UVB 对周丛生物膜的光合作用有抑制作用，其中UVB 对周丛生物膜光合作用的抑制作用强于UVA.具体表现为抑制PSII 系统反应中心活性，抑制PSII 的最大光化学效率，减少PSII 具有活性的反应中心数量，改变周丛生物膜的能量通量变化，但本实验结果表明，在经过12 h 的恢复后，周丛生物膜可以通过自身修复抵抗UVA、UVB 对其光合作用的毒性作用，恢复一定的光合作用.