国产雪茄烟叶堆积发酵过程中的微生物变化规律及差异分析

潘 勇，吴巧茵，李林林，谭再钰，李俊瑶，张 娟，施友志

（1. 湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040；2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；4. 江南大学 未来食品科学中心，江苏 无锡 214122）

近年来，国产雪茄的产量与销售迅速增加，销售年均增长率达到39.13%，但国产雪茄受风格特征与原料的限制难以更好地突破高端雪茄市场[1-2]。长期以来，雪茄生产原料依赖于进口，存在成本昂贵、原料质量不够稳定、发酵时间较长、品质风格受限等不利因素；而国产雪茄烟叶原料受工艺条件不够成熟、地理环境差异、气候性因素的限制，在品质上未能达到国外进口烟叶的水平[3]。雪茄生产对于烟叶原料的要求极高，不同部位烟叶制成雪茄后致香成分有着比较明显的差别，下部烟叶的烟碱含量、总氮含量、多酚含量等低于中部烟叶，使得下部烟叶在发酵后致香成分含量较低，制得雪茄香气较淡、吃味寡淡，在雪茄烟叶等级评定与烟叶发酵生产中劣于中上部烟叶[3-6]。

堆积发酵是雪茄烟叶香气物质产生和品质提升的关键环节之一，国产雪茄生产仍处于起步的初级阶段，堆积过程中的发酵机制以及衡量雪茄发酵质量的指标仍尚待挖掘。已有大量研究对烟叶种植方式与烟叶产量质量进行了分析，对不同发酵阶段的研究主要是不同生理生化指标与烟叶香韵、致香物质的分析，而对于雪茄发酵的相关研究，尤其是对发酵机制的研究仍较为有限[5，7-9]。

为了提升国产雪茄在国际市场中的竞争力，还需进一步提高国产烟叶工业可用性，形成一套完善的雪茄发酵工艺[2]。因此，研究国产雪茄烟叶堆积发酵过程中微生物的变化规律与不同产区、不同部位烟叶微生物的差异，对于强化国产雪茄烟叶发酵技术、增强下部雪茄烟叶香气、提升雪茄发酵品质具有重要意义。鉴于此，采用高通量测序技术分析湖北十堰与四川德阳2 个产区中、下部的雪茄烟叶原料在堆积发酵过程中不同发酵节点优势微生物的变化，解析堆积发酵中优势微生物的变化规律及十堰与德阳烟叶特有微生物的差异，为生产高质量国产雪茄、形成国产雪茄特征风格提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以湖北十堰产区的CX14 品种的中、下部烟叶及四川德阳产区的DX4 品种的中、下部烟叶作为试验的研究对象，样品编号：A 为十堰产区品种CX14的中部一级烟叶、B为十堰产区品种CX14的下部一级烟叶、C 为德阳产区品种DX4 的中部一级烟叶、D为德阳产区品种DX4的下部一级烟叶。对烟叶原料进行堆积发酵，湖北中烟工业有限责任公司堆垛发酵室的温度为21～25 ℃，湿度控制在60%～70%，从发酵0 d 的原烟开始取样，烟叶每发酵7～10 d 进行一次翻垛，每次翻垛都进行一次取样至发酵结束，共有5 个节点，分别为烟叶的原烟时期（T0，0 d）、发酵前期（T1，7 d）、发酵中期（T2，14 d）、发酵后期（T3，21 d）、发酵结束（T4，30 d）。采集好的样品用自封袋密封，保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 取5 g 烟叶在预冷的研钵中用液氮研磨成粉末，将烟叶粉末与100 mL 无菌的0.9%生理盐水加入500 mL 带挡板的三角摇瓶中，在10 ℃、220 r/min 振荡培养箱（ZQZY-AFS，知楚）中，振荡2～3 h 洗脱烟叶总微生物；使用台式高速大容量离心机（5810R，Eppendorf）在4 ℃、7 000 r/min 离心10 min，收集沉淀即为烟叶的总微生物；使用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01，Omega Biotek 公司）提取烟叶总微生物DNA。

1.2.2 扩增子测序 以细菌和真菌DNA 为模板，分别以细菌通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）/907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）和真菌通用 引 物ITS1（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）/ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）对细菌的V4—V5 区和真菌ITS1—ITS2 区域进行扩增，采用0.8%琼脂凝胶电泳检测扩增产物，并利用Illumina Hiseq对群落DNA 进行双端测序。原始序列经过去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等步骤，得到烟叶样品的物种组成和丰度信息[10]。

1.2.2 数据统计与分析 应用QIIME 2、Excel 2021和Origin 2022 软件对获得的烟叶微生物数据进行统计分析和绘图，通过计算α 多样性指数和组间差异分析对不同产区、部位烟叶样品微生物多样性进行分析。使用QIIME 2 计算烟叶菌群的α 多样性指数（以Chao1 指数表征群落丰富度，以Simpson 指数表征群落多样性），应用R 语言的vegan 包进行基于置换检验的多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）测试堆积发酵过程中每个发酵节点之间的差异[11]。以烟叶样品中相对丰度在前20的微生物作为分析对象，使用R语言的Venn Diagram 包统计共有微生物和特有微生物并绘制Venn 图；使用LEfSe 分析（LDA effect size 分析）展示每个烟叶样品内显著富集的物种[12]。使用Origin 2022 和Excel 2021 对烟叶样品中任意节点任意样品中相对丰度超过2%的微生物的相对丰度进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同产区、部位烟叶微生物多样性分析

2.1.1 不同产区、部位烟叶细菌多样性分析 在整个堆积发酵过程中，不同产区、部位烟叶细菌群落α多样性分析结果如图1 所示。十堰中部烟叶Chao 1指数在发酵过程中先升高后降低，最后基本趋于平稳；Simpson 指数呈现稍有降低后逐渐升高的趋势。十堰下部烟叶Chao 1 指数先升高后降低，最后基本趋于平稳；Simpson 指数在发酵过程中先降低后升高再降低，最后稍有升高。德阳中部烟叶Chao 1 指数呈先升高后降低再升高的趋势，Simpson 指数在发酵过程中呈先降低后升高再升高的趋势，在发酵结束时升高。德阳下部烟叶Chao 1 指数在发酵过程中逐渐降低，Simpson 指数在发酵前期上升后逐渐降低。

图1 不同产区、部位烟叶细菌菌群α多样性分析Fig.1 Bacterial alpha diversity of tobacco leaves in different origins and leaf parts

对不同产区、部位烟叶在整个堆积发酵过程中细菌群落进行组间差异分析，如图2所示，十堰产区烟叶细菌群落在原烟时期与发酵前期组间差异较小，发酵中期时细菌菌群具有显著变化；德阳产区烟叶细菌菌群在发酵前期具有显著变化，发酵中期至发酵结束的菌群组间差异较小。以上结果表明，同一产区中、下部烟叶在堆积发酵过程中细菌菌群发生显著变化的关键节点相似，推测发酵前期或发酵中期可能是堆积发酵过程中细菌微生物群落组成与丰度显著变化的节点，且不同产区烟叶细菌微生物群落变化的节点具有较大差异。

图2 不同产区、部位烟叶细菌群落组间差异分析Fig.2 Bacterial difference analysis between groups of tobacco leaves in different origins and leaf parts

2.1.2 不同产区、部位烟叶真菌多样性分析 在整个堆积发酵过程中，不同产区、部位烟叶真菌群落α多样性变化如图3 所示。十堰中部烟叶真菌Chao 1指数在发酵过程中呈先上升后下降的趋势，Simpson指数在发酵过程中先上升后下降，最后再次上升。十堰下部烟叶真菌Chao 1 指数在发酵过程中整体呈先上升后下降的趋势，Simpson 指数在整个堆积发酵过程中逐渐下降。德阳中部烟叶Chao 1 指数和Simpson 指数在发酵过程中呈增加-降低-增加-降低的趋势，德阳下部烟叶真菌Chao 1 指数和Simpson 指数在发酵过程中呈先增加后降低的趋势，最后略有增加。

图3 不同产区、部位烟叶真菌群落α多样性分析Fig.3 Fungal alpha diversity of tobacco leaves in different origins and leaf parts

图4 为不同产区、部位烟叶真菌群落的组间差异分析。从图4 可以看出，只有德阳中部烟叶真菌菌群在发酵中期具有显著变化，而其余烟叶真菌群落在整个堆积发酵过程中均具有较大变化，说明烟叶真菌在堆积发酵过程中不同发酵节点变化较大。

图4 不同产区、部位烟叶真菌群落组间差异分析Fig.4 Fungal difference analysis between groups of tobacco leaves in different origins and leaf parts

2.2 不同产区、部位烟叶物种组成分析

2.2.1 不同产区、部位烟叶细菌物种组成 图5a为不同产区、部位烟叶在堆积发酵过程中相对丰度在前20 的细菌Venn 图，烟叶样品之间既有共性也有差异，在不同产区、部位烟叶中共有的细菌属共有9个，分别是气球菌属（Aerococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium_1）、不动杆菌属（Acinetobacter）、绿细菌属（Chloroplast）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、假 单 胞 菌 属（Pseudomonas）、Mitochondria，这些共有物种可能参与了堆积发酵中的有害物质降解和香气成分转化[5-6]。

图5 不同产区、部位烟叶共有微生物物种Fig.5 Shared microbial species of tobacco leaves in different origins and leaf parts

2.2.2 不同产区、部位烟叶真菌物种组成 图5b为不同产区、部位烟叶在堆积发酵过程中相对丰度在前20 的真菌Venn 图，烟叶样品之间既有共性也有差异，在不同产区、部位烟叶中共有的真菌属共有6个，分 别 是 曲 霉 属（Aspergillus）、链 格 孢 菌 属（Alternaria）、微 子 囊 菌 属（Microascus）、Sampaiozyma、青 霉 属（Penicillium）、枝 顶 孢 属（Acremonium）、镰孢属（Fusarium）。

2.2.3 不同产区、部位烟叶特征微生物 应用LEfSe 分析不同产区、部位烟叶的特征微生物，结果如图6 所示。从图6 可以看出，十堰产区烟叶的特征细菌属有费克蓝姆氏菌属（Facklamia）、水杆菌属（Aquabacterium）；德阳产区的特征细菌属有盐单胞菌属（Halomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、砷氧化菌（Aliihoeflea）和涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）。其余各烟叶样品还有特征细菌属，十堰中部烟叶的乳杆菌属（Lactobacillus）、弯杆菌属（Flectobacillus），十堰下部烟叶的海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）；德阳中部烟叶的酸杆菌属（Acidibacter）、孢囊菌属（Dactylosporangium）和WD2101_soil_group 及德阳下部烟叶的泛菌属（Pantoea）等。

图6 不同产区、部位烟叶微生物LEfSe分析Fig.6 Microbial LEfSe analysis of tobacco leaves in different origins and leaf parts

十堰产区的特征真菌属为刺盘孢菌属（Colletotrichum）和单端孢属（Trichothecium），德阳产区烟叶特有的真菌属为轮枝孢属（Verticillium）和枝孢菌属（Cladosporium）。其余各烟叶样品还有特征真菌属，十堰中部烟叶的赤霉菌属（Gibberella）、间座壳属（Diaporthe），十堰下部烟叶的篮状菌属（Talaromyces），德阳中部烟叶的柄孢壳属（Podospora）及德阳下部烟叶的红酵母属（Rhodotorula）等。

2.2.4 堆积发酵过程中优势细菌物种组成与变化

选取在整个堆积发酵过程中相对丰度在前20，且在任意发酵节点相对丰度超过2%的细菌属进行优势细菌物种组成分析，结果如图7a所示。葡萄球菌属、气球菌属和棒状杆菌属是各产区共有的优势细菌，不同产区烟叶优势细菌在发酵过程中具有较大差异。

图7 堆积发酵过程中不同产区、部位烟叶优势微生物物种变化Fig.7 Changes of tobacco leaf dominant microobial species in different origins and leaf parts during stacking fermentation

葡萄球菌属是不同产区烟叶原烟时期、发酵前期的优势细菌，随着发酵的进行，不同产区、部位的优势细菌组成和丰度变化存在差异。十堰产区烟叶优势细菌在整个发酵过程中变化规律类似，发酵前期以葡萄球菌属为优势细菌，随着发酵过程进行，葡萄球菌属相对丰度逐渐下降，优势细菌转变为气球菌属和棒状杆菌属。德阳产区发酵前期的优势细菌是葡萄球菌属，气球菌属和棒状杆菌属在发酵前期和发酵中期相对丰度增加，随着发酵的进行，德阳中部烟叶的优势细菌转变为盐单胞菌属，而德阳下部烟叶中葡萄球菌属始终占优势地位。酸杆菌属、孢囊菌属和WD2101_soil_group 是德阳中部烟叶的特有微生物，在发酵结束时相对丰度迅速增加。

2.2.5 堆积发酵过程中优势真菌物种组成与变化

选取在整个堆积发酵过程中任一发酵节点相对丰度超过2%的真菌属进行优势真菌物种组成分析，结果如图7b所示。十堰产区中部烟叶的优势真菌是曲霉属，在发酵后期，链格孢属、微子囊菌属相对丰度增加，转变为优势真菌。在十堰产区下部烟叶的发酵前期，曲霉属相对丰度迅速减少，篮状菌属是十堰下部烟叶中特有的微生物且在发酵前期和发酵结束保持优势地位，在发酵前期至发酵后期链格孢菌属相对丰度增加成为优势真菌。德阳产区中、下部烟叶在整个发酵过程中以曲霉属为优势真菌，德阳产区中部烟叶在发酵前期与发酵中期节担菌属和微子囊菌属相对丰度增加，参与组成了烟叶的优势菌。

关联分析4个烟叶样品可知，曲霉属、链格孢属和微子囊菌属是各产区共有的优势真菌，不同产区烟叶优势真菌组成与丰度变化在发酵过程中具有较大差异。曲霉菌属是各烟叶样品原烟时期和发酵前期的优势真菌，链格孢菌属、微子囊菌属在发酵中期、发酵后期相对丰度增加，组成烟叶的优势真菌。

3 结论与讨论

本研究中，德阳中部烟叶的微生物群落丰富度在堆积发酵过程中呈上升趋势，其余烟叶样品微生物群落丰富度随着发酵的进行呈下降趋势，德阳产区中部烟叶在发酵后期群落丰富度增加，可能是德阳产区的特有微生物对群落结构变化的影响。中部烟叶微生物群落多样性在发酵过程中基本呈上升趋势，下部烟叶群落多样性随着发酵的进行基本呈下降趋势。堆积发酵过程中，中部、下部烟叶微生物群落多样性变化的差异可能是因为中部烟叶稍厚油分较多，总糖含量、烟碱、总氮含量与下部烟叶相比较高，在堆积发酵时利于微生物繁殖，下部烟叶群落多样性在发酵后期至发酵结束减少，可能是导致下部烟叶生产的雪茄香气、吃味上不如中部烟叶的原因[5，13-14]。前人以海南中部烟叶为研究对象，其细菌群落多样性随着发酵的进行呈先增加后降低的趋势[15-16]，与本研究结果相似。

本研究中，十堰产区中部、下部烟叶细菌优势微生物与德阳产区中部、下部烟叶细菌优势微生物在整个发酵过程中变化规律相似，但中部烟叶与下部烟叶总糖、氨基酸、香气物质含量等存在较大差异，造成中、下部烟叶品质差异可能是因为下部烟叶结构疏散、含水量较高，长时间的高温高湿发酵环境在发酵过程中会促使糖分和多酚类物质快速转化过多，加速烟叶褐变和霉变的风险，影响烟叶品质[17]。

烟叶微生物和环境变化协同作用下，雪茄烟叶发酵过程中大分子物质降解、小分子物质转化、香气物质生成，推动雪茄特殊品质的形成[18-19]。本研究中，同一部位不同产区的烟叶在优势微生物的结构上存在较大差异，在不同发酵节点起到主要作用的微生物也不完全相同，这与产区特有微生物和环境因素、微生物之间的互作关系相关[20]。在发酵前期，中等酸性和中温环境适宜葡萄球菌属、气球菌属等菌株的生长。意大利托斯卡诺雪茄烟叶在发酵过程中，葡萄球菌属与棒状杆菌属的变化与十堰产区烟叶相似，可能是由于葡萄球菌属、气球菌属对烟叶还原糖、苹果酸和柠檬酸的利用，导致温度和pH 值升高，从而促进耐盐、抗逆性强的棒状杆菌属的生长[21]，与本研究中发酵结束时棒状杆菌属相对丰度增加相符合。德阳产区下部烟叶葡萄球菌属丰度变化与前人[22-24]研究结果相似，在菌群发生显著变化的发酵前期与发酵中期，氨基酸运输和代谢及碳水化合物运输和代谢功能丰度更高。通过比较菌群优势菌组成与丰度的相似之处，可为更好地挖掘优势微生物的发酵作用及国产雪茄特征风格的确定提供指导。

本研究中，葡萄球菌属、气球菌属、棒状杆菌属、盐单胞菌属等属于烟叶的主要优势细菌，据报道可能在堆积发酵过程中具有增加香气成分、降解有害成分等作用[21，25]。关于葡萄球菌属在烟叶中应用的报道较少，已有研究报道在发酵香肠中接种葡萄球菌菌剂利用蛋白质和脂肪产生酸和醇类物质，酯化反应后醛类、酯类物质含量增加，使得食品的清新味、甜香味、果香味和花香味更加浓郁[25-26]。随着烟叶发酵的进行，温度和pH 升高，棒状杆菌的耐盐性使其能够生长较好[21]。有研究报道，气球菌属、盐单胞菌属是腌制麻竹笋的优势微生物，具有耐盐、抗逆性较强的特点，且在雪茄烟叶研究中也能检测到[21，27]；通过Pearson 相关分析发现，盐单胞菌属、涅斯捷连科氏菌属与3-甲基丁醛、2-庚酮、己醛、辛醛及己酸乙酯等具有水果香、花香的物质呈正相关[28]。雪茄堆积发酵过程中的优势真菌如曲霉属、篮状菌属在发酵过程中也具有改善烟叶品质、提升香气的功能。全铭沁等[29]将1株能够分泌淀粉酶和蛋白酶的黑曲霉应用于上部烟叶中，发酵后的烟叶劲头下降、杂气量减少，香气得到了提升。另外，在分离根际微生物时分离到1株篮状菌，应用该菌能够抑制有害菌的繁殖，使有益微生物的相对丰度上升[30]。除优势微生物外，烟叶特有微生物如芽孢杆菌属、砷氧化菌属、乳杆菌属、海洋芽孢杆菌属、刺盘孢菌属、单端孢属、枝孢菌属、赤霉菌属、间座壳属、红酵母属等在本研究烟叶样品中相对丰度较低，但在其他研究中均有报道是烟叶的优势微生物，且在分泌淀粉酶、蛋白酶等关键酶降解大分子物质、生成特征香气成分中具有重要作用[16，22]。本研究中，葡萄球菌属、气球菌属、棒状杆菌属、盐单胞菌属等优势微生物可能通过产酶、影响菌群结构等对雪茄烟叶香气提升和国产雪茄生产具有至关重要的作用，其代谢活动和发酵机制还需进一步的研究，并通过菌剂制备与人工构建微生物群落应用于下部烟叶的发酵生产。