UPLC-QQQ-MS测定叠鞘石斛与铁皮石斛中三种单糖含量的研究*

兰 英，郑 佳，李 欧，封家福

(乐山职业技术学院，四川 乐山 614000)

石斛是我国传统的名贵中药，应用历史悠久，被道家称为中华九大仙草之首，具有滋阴清热、生津养胃之功效[1]。近年来，浙江云南、广东、广西、湖南、安徽等省都积极发展石斛产业，石斛产业已成为我国中药产业中一个热点[2]。根据《中国植物志》第19卷记载，四川南部(长宁、峨眉山、乐山)是石斛的地道产区之一。目前，乐山市辖属的夹江县歇马乡是石斛的主要产区，主要栽培品种包括叠鞘石斛(DendrobiumdenneanumKerr.)、铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)等[3-4]。然而，石斛药材基原复杂[5]。现有的研究，包括化学成分和药理活性的研究主要是集中于铁皮石斛、金钗石斛等药典收载品种[6-11]，对于叠鞘石斛的研究较少，因而无法进行有效的品质评价和建立专属的质量标准，严重制约石斛产业做大、做强。

多糖类化合物是天然药物的主要活性成分之一，对多糖组成的分析对解释多糖在生物体内的作用机制具有重要意义[12-13]。然而，以多糖为指标对不同产地的叠鞘石斛与铁皮石斛多糖及其化学分析方法进行比较却不多见。因此，本研究选择乐山地道中药叠鞘石斛为研究对象，以中国药典收录品种铁皮石斛为参照，采用柱前衍生化结合超高效液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱(UPLC-QQQ-MS)检测技术，对同2种石斛多糖水解后的单糖组成进行比较分析，从单糖组成和含量来探究不同种类石斛多糖的组成和结构特点，为后续质量标准的制定和谱效关系研究提供参考。

1 实 验

1.1 仪 器

Agilent Technologies 1290 Infinity超高效液相色谱仪串联Agilent 6460三重四级杆质谱仪，美国Agilent公司；十万分之一电子天平，美国Sartorius公司；Eppendorf 5810R 高速离心机，德国Eppendorf公司。

1.2 材料与试剂

总共6批叠鞘石斛与铁皮石斛样品均实地采集于各自主要产区。经鉴定分别为兰科植物叠鞘石斛DendrobiumdenneanumKerr.、铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥茎。

甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甲酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)购于美国Simga公司；色谱级乙腈、试剂级乙醇购于德国Merck公司；试验用超纯水以美国Millipore公司 Milli-QTM净化系统制备。

1.3 色谱与质谱条件

色谱柱Waters BEH C18(1.7 μm， 2.1×100 mm)和保护柱VanGuardTM(BEH， C18， 1.7 μm， 2.1×5 mm)；流动相：水(含0.01%甲酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～2 min，5% B；2～25 min，5%～25% B)；柱温30 ℃，流速0.2 mL·min-1，进样量1 μL。

离子化模式ESI+下，采取多反应监测(MRM)检测并进行定量分析；离子化温度(TEMP)550 ℃；GaTP1为379.2 kPa (55 psi)，Gas2为379.2 kPa(55 psi)；气帘气(Curtain Gas)为241.3 kPa(35 psi)同时对检测离子对、去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)进行优化。三种目标成分的优化质谱检测条件参数见表1。

表1 三种单糖成分测定中优化的质谱条件参数Table 1 Parameters of optimized mass spectrometry conditions in the determination of three monosaccharide components

1.4 对照品溶液制备

分别精密称取D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖三种单糖对照品1.0 mg，将对照品分别置于1 mL容量瓶中，用超纯水定容，使其配置成1.0 g·L-1的对照品储备液。精密移取各储备液各0.1 mL，超纯水定容至1.0 mL，制备成最终浓度为 100 mg·L-1的单糖混合标准溶液，备用。

1.5 供试品溶液制备

1.5.1 石斛多糖的提取与水解

精密称取叠鞘石斛与铁皮石斛样品粉末约0.1 g(过三号筛)，置索氏提取器中，加80%乙醇50 mL，加热回流提取4 h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100 mL，煎煮1h，并时时搅拌，放冷，加水补至约100 mL，混匀，离心，备用。

吸取上述多糖溶液1 mL，置于10 mL安瓿瓶中，加 3.0 mol·L-1的盐酸溶液0.5 mL，封口，混匀，110 ℃水解 1 h，放冷，用3.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节pH值至中性后定容，备用。

1.5.2 对照品与石斛样品的PMP衍生化

将三种单糖混合标准溶液连续稀释至质量浓度为0.01～1000 μg·L-1。吸取400 μL混合标准品溶液与400 μL PMP溶液与400 μL 0.3 mol/L氢氧化钠溶液充分震荡混匀后置于70 ℃烘箱反应100 min。反应结束后向上述溶液中加入500 μL 0.3 mol/L盐酸，混匀后再加入2 mL氯仿溶液，充分震荡混匀后，静置5～10 min，取上层液体重复加氯仿洗涤2～3次后，过0.22 μm微孔滤膜后，备用。

精密吸取1.5.1项下的叠鞘石斛与铁皮石斛多糖水解液400 μL，按以上相同方法衍生化处理后，既得衍生化的石斛样品供试溶液。

2 结果与讨论

2.1 线性关系与灵敏度试验

将每种1 μL对照品溶液用于色谱-质谱条件下进样测定，并用对照品的峰面积和对照品的质量浓度绘制校准曲线，确定回归方程、相关系数和线性范围。分别设定信噪比(S/N)分别为3和10为检测限(LOD=3)与定量限(LOQ=10)灵敏度阈值。结果见表2，三种单糖均显示回归线的相关系数R2>0.999，呈现良好的线性关系。

表2 三种单糖成分线性范围、回归方程和相关系数Table 2 Linear range， regression equation and correlation coefficient of three monosaccharide components

2.2 精密度试验

精密吸取一定浓度的混合对照品衍生化溶液1 μL，于“1.3”项下色谱-质谱条件下连续进样6次，通过测定各对照品的峰面积，计算三种对照品峰面积的RSD，其范围在1.66%～1.89%，表明仪器精密度较好。

2.3 重复性试验

取TP1样品6份，每份0.1 g，精密称定，按“1.5”所述平行制备6份石斛样品的供试溶液，于“1.3”项下色谱-质谱条件下进样测定，计算三种目标成分质量分数的RSD，为2.58%～3.67%，表明方法重复性较好。

2.4 稳定性试验

取TP1样品的供试溶液，分别在 0 h、2 h、4 h、8 h、 12 h、24 h后进行测定，于“1.3”项下色谱-质谱条件下进样测定，计算三种目标成分峰面积的RSD，其范围在2.17%～2.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.5 回收率试验

精密称取 TP1样品6份，每份1.0 g，分别加入与1.0 g样品中各待测成分含量相当的对照品，照“1.5”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算加样回收率和RSD，计算4个成分的平均加样回收率为99.62%～102.31%，RSD<2.67%，表明方法回收率良好。

表3 测定方法的方法学考察结果Table 3 Methodological investigation results of the determination method

2.6 样品测定

采用UPLC-QQQ-MS法测定了6批样品中三种单糖的组成和含量，结果见图1和表4。

图1 三种单糖供试溶液的MRM图Fig.1 MRM diagrams of three monosaccharide test solutions

表4 叠鞘石斛与铁皮石斛三种单糖的含量Table 4 Contents of three monosaccharides in Dendrobium denneanum and D. officinale

结果表明，叠鞘石斛与铁皮石斛均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖。同时，叠鞘石斛与铁皮石斛多糖各单糖组分中均以甘露糖含量最高，平均含量高达267.8 mg/g，其次为葡萄糖(175.3 mg/g)以及半乳糖(31.9 mg/g)。

3 结 论

本试验样品前处理方法参照中国药典中铁皮石斛项下，但色谱条件略加改进，各个单糖衍生物的峰很好地分离，不影响单糖组分的测定。石斛多糖经过PMP柱前衍生化，再用UPLC-QQQ-MS进行测定具有简单、快速、灵敏、准确、重现性好等优点，为不同种源的铁皮石斛及叠鞘石斛的定性鉴别及药材内在质量评价提供新的参考依据。

试验结果表明，以单糖为评价指标，甘露糖在铁皮石斛中的含量较高，半乳糖在叠鞘石斛中含量较高，葡萄糖在两种石斛中含量基本一致。尽管含量不同，但铁皮石斛及叠鞘石斛样品均检出甘露糖、葡萄糖、半乳糖三种单糖，因此不同种源的两种石斛有可以替代使用的可能性。

此次研究方法的确立以叠鞘石斛与铁皮石斛中的三种单糖含量为指标，不仅提高了分析方法的科学性与准确性，而且可实现叠鞘石斛与铁皮石斛质量比较的目的，实现了叠鞘石斛与铁皮石斛药效基础物质的关联，为石斛产业在栽培技术、质量标准及新药创制等中药产业化示范提供了有力的支撑。