基于功能性状评价7种核桃砧木幼苗水分利用效率

刘丙花，张纪霞，唐贵敏，赵登超，梁 静

(1.山东省林业科学研究院，山东 济南 250014；2.山东省蒙阴县自然资源和规划局，山东 临沂 276200；3.山东英才学院，山东 济南 251400)

随着全球气候变化的加剧及人口增长与工农业生产规模的迅速扩大，日益严重的淡水资源短缺已经成为世界许多地区农林产业发展的主要限制因子之一。发展节水农业是实现有限水资源高效利用的必由之路，在节水抗旱工程技术成本较高的情况下，发展生物节水技术，提高植物水分利用效率(WUE)，是实现节水农业和农业可持续发展的重要战略措施[1-3]。WUE是指植物消耗单位水分所生产干物质的量，反映了植物-土壤-大气之间的碳水循环关系，是评价植物对生境适应程度的重要特征参数之一，已成为揭示陆地植被生态系统对全球变化响应和适应对策的重要手段[4-5]。植物不同种质资源间形态结构和CO2同化方式等的不同引起水分吸收利用和产量形成的差异，最终导致不同种质资源间WUE的差异[6-8]。选择高WUE的优良作物品种是实现干旱条件下作物丰产稳产和提高农田WUE的根本途径[1,9]。

核桃(JuglansregiaL.)是世界四大坚果之一，广泛种植于我国西北、西南及华北各省、自治区，在调整农村产业结构、增加农民收入和保障生态安全等方面发挥着重要作用[10]。目前，我国核桃多种植在土壤相对贫瘠的丘陵山地，水资源匮乏直接影响核桃建园成活率、树体生长发育及坚果产量和品质的形成，严重制约了我国核桃产业的高水平发展。筛选高效用水优良核桃砧木，把优良的核桃品种嫁接在水分高效利用的砧木上，提高核桃树体WUE，是实现干旱、半干旱核桃栽培区有限水资源的高效利用，提升我国核桃产业化发展水平的重要途径之一。本研究以我国常用的7种核桃砧木实生幼苗为试验材料，在温室条件下开展盆栽控水试验，通过测定干旱条件下不同核桃砧木实生幼苗的长期水分利用效率(WUEL)和水分利用相关功能性状，分析WUEL与各水分利用功能性状间的相关性，并分别采用模糊数学隶属函数法、主成分分析法和聚类分析法对7种核桃砧木实生幼苗的水分利用特性进行综合评价，以期为核桃砧木高效用水种质资源的选育提供科学理论依据和现实材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018—2019年在山东省济南市山东省林业科学研究院实验室及苗木生产繁育基地进行(36°40′N，117°00′E)。选择大小均匀且无虫害的7种核桃砧木种子(砧木特性及来源见表1)分别置于50 L水桶中，注入清水(水面高于种子)浸种7～10 d，每天换水1次。在晴天将种子取出平摊于室外水泥地面暴晒使其开裂，将裂口的种子与河沙按体积比1∶5混匀，置于温室，每天喷水保持湿度65%～75%，进行催芽。待种子长出白色嫩根，将其播种于轻基质无纺布容器内，置于温室进行常规水肥管理。待幼苗长至3～4片功能叶片时，选取长势均匀一致的幼苗移栽至塑料盆(底径、口径、高分别为23、38、40 cm;盆土为园区表土、沙和草炭按体积比5∶1∶1混匀，pH=7.16)中，置于温室进行常规水肥管理。

表1 7种核桃砧木种质资源特性及来源Table 1 Origins and principal characteristic description for the seven walnut rootstock species used in the study

1.2 试验设计

移栽缓苗2周后，每种核桃砧木选取长势均匀一致的30盆植株用于试验。其中，对照组15盆植株进行正常供水，保持盆中土壤相对含水量为饱和含水量的65%～75%；处理组15盆植株进行干旱胁迫，保持盆中土壤含水量为饱和含水量的45%～55%。试验处理5月20日开始，7月21日结束，期间每天18∶00采用土壤温湿度检测仪(ZTS-Ⅱ，浙江托普仪器有限公司)测定土壤含水量，进行浇水并记录浇水量。为减少表层土的水分蒸发，每盆表面覆盖2～3 cm细沙，采用称重法测定不同处理的土壤表面蒸发失水量。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 生长指标 试验结束时，对不同处理的核桃砧木幼苗进行生长指标测定。株高(PH)用米尺(1 mm)从土壤表面至主干顶芽测定，地径(BD)和叶片厚度(LT)用电子游标卡尺(0.001 mm)分别在主干的土壤表面接触处和主脉两侧避开大侧脉测定。将不同处理的不同核桃砧木幼苗分别拔出、洗净，分为叶片、枝干和根系3部分，记录一级侧根数(NRL)，用电子天平(0.01 g)分别称量地上部鲜重和根系鲜重，计算根冠比(RSR=根系鲜重/地上部鲜重)；用叶面积扫描仪(YMJ-CH，浙江托普仪器有限公司)累计测定总叶面积(TLA)，用直尺(1 mm)测量主根长度(ARL)。之后烘干至恒重，用电子天平(0.01 g)称量各部分干重，以各部分总干重(TDB)表示生物量。

比叶面积(SLA)=总叶面积(cm2)/叶片总干重(g)

1.3.2 叶片叶绿素含量(Cchl)、相对含水量(RWC)和保水力(WHC) 试验结束时，在晴天18∶00—19∶00 对不同处理的砧木苗从顶端数第3～4个成熟叶片进行取样，置于冰盒，带回实验室。叶绿素含量采用95%乙醇浸提比色法测定[11]，RWC和WHC采用称重法测定[10]。

1.3.3 长期水分利用效率(WUEL)WUEL为试验期间植株生物产量与其蒸腾水分总量之比,在试验开始和结束时，分别选择不同处理的植株3棵，拔出、洗净，烘干至恒重，用电子天平(0.01 g)称量干物质量。试验周期内的总浇水量减去土壤表面蒸发失水总量即为蒸腾水分总量。

WUEL=(WF-WI)/WW

式中,WI和WF分别为处理开始和结束时植株的干物质重(g)；WW为植株的蒸腾失水总量(kg)。

1.3.4 叶片净光合速率(Pn)和光系统Ⅱ的最大光化学效率(Fv/Fm) 处理结束时，在晴天9∶00—11∶00 采用Li-6400 XT便携式光合仪(美国LI-COR公司)进行叶片光合参数测定，得到Pn；采用FMS-2型脉冲调制式荧光仪(英国Hansatech公司)测定叶绿素荧光参数得到初始荧光参数(Fo)与暗适应(20 min)后的最大荧光参数(Fm)。Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。

1.4 数据分析

不同处理的每个砧木至少重复测定6株，取平均值。采用Microsoft Office Excel 2010和IBM.SPSS Statistics 20.0进行数据处理和统计分析，采用Sigma Plot 10.0软件进行作图。采用Duncan法进行样本之间的多重比较(P=0.05);采用One-way ANOVA分析核桃砧木对功能指标的影响；采用Pearson相关系数进行相关性分析；基于14个水分利用相关功能性状，分别采用模糊数学隶属函数法、主成分分析法和系统聚类分析法对7种核桃砧木幼苗的WUE进行综合评价。

2 结果与分析

2.1 干旱条件下不同核桃砧木幼苗的长期水分利用效率(WUEL)

由图1可看出，在干旱条件下，7种核桃砧木幼苗的WUEL存在显著差异(P<0.001)。WUEL由高到低的顺序依次为鸡爪绵(66.26 g·kg-1)、香玲(60.05 g·kg-1)、核桃楸(52.67 g·kg-1)、麻核桃(47.78 g·kg-1)、黑核桃(41.88 g·kg-1)、铁核桃(37.38 g·kg-1)和枫杨(32.85 g·kg-1)。

2.2 干旱条件下核桃砧木幼苗水分利用相关功能性状及其与WUEL的相关性

在干旱条件下，7种核桃砧木的14个水分利用相关功能性状的平均值、标准方差、变异系数和方差分析如表2所示。单因素方差分析结果表明，砧木类型对核桃砧木幼苗的14个高效用水性能指标均存在显著影响(P<0.01)。干旱条件下，7种核桃砧木14个功能性状指标均存在不同程度差异，除Fv/Fm(变异系数为8.397%)外，其他13个功能性状的变异系数均>10.00%。其中PH、BD、TDB、RSR、ARL、NLR、TLA、SLA和Cchl的变异系数>20.00%，存在较大的种间差异。Pearson相关性分析表明WUEL与PH、BD、TDB、RSR、ARL、NLR、TLA、LT、RWC、WHC、Cchl、Pn和Fv/Fm均呈正相关性，与SLA呈负相关性(表3)。

注：MW—麻核桃，IW—铁核桃，BW—黑核桃，MCW—核桃楸，CW—枫杨，JZM—鸡爪绵，XL—香玲；FRootstock:砧木种类对WUEL的影响；不同小写字母表示不同核桃砧木幼苗同一指标间在0.05水平上的差异显著；***：在0.001水平上影响显著。下同。Note:MW— Ma walnut,IW— Iron walnut,BW— Black walnut,MCW— Manchurian walnut,CW— Chinese wingnut,JZM— Jizhuamian,XL— Xiangling;FRootstock:effect of rootstock species on WUEL;Lowercases letters show statistically significant differences at 0.05 level among different walnut rootstocks for each parameter;***:significant effect at 0.001 level.The same below.图1 干旱条件下7种核桃砧木实生幼苗的长期水分利用效率(WUEL)Fig.1 WUEL of the seven walnut rootstock seedlings under drought condition

表2 干旱条件下7种核桃砧木幼苗水分利用相关功能性状的平均值、标准方差、变异系数和方差分析Table 2 Mean,standard deviation,coefficient of variation and one-way ANOVA for the water-use related functional traits of the seven walnut rootstock species under drought condition

2.3 7种核桃砧木幼苗水分利用效率的综合评价

2.3.1 模糊数学隶属函数评价法 植物WUE是一个复合性状，单一指标不能说明水分利用能力的高低。本研究基于干旱条件下14个水分利用相关功能性状的变化及其与WUEL的相关性分析(表3)，采用模糊数学隶属函数法对7个核桃砧木水分利用性能进行综合评价，结果见表4。根据各指标隶属函数平均值的大小对不同核桃砧木的水分利用能力进行排序，由高到低的顺序为：鸡爪绵、香玲、核桃楸、麻核桃、铁核桃、黑核桃和枫杨。

表3 干旱条件下7种核桃砧木实生幼苗的WUEL与其水分利用相关功能性状的相关性Table 3 Pearson correlation coefficients between WUEL and water-use related functional traits of the seven walnut rootstock seedlings

表4 干旱条件下不同核桃砧木幼苗各测定指标的隶属函数值Table 4 Subordinate function values of the seven walnut rootstock seedlings under drought condition

2.3.2 主成分分析评价法 将反映核桃砧木水分利用能力的14个功能性状转化为14个主成分，进行主成分分析，结果如表5所示，主成分分析提取了特征值大于1的3个主成分，累计方差贡献率为77.487%。主成分因子负荷大于0.600的视为显著。主成分1(PC1)主要包括PH、TDB、RSR、ARL、NLR和TLA，是反映水分高效利用的植株生长、生物量积累与分配及根系形态指标，方差贡献率为53.133%；主成分2(PC2)主要包括Cchl、Pn和Fv/Fm，是反映水分高效利用的叶片光合生理指标，方差贡献率为15.227%；主成分3(PC3)主要包括LT、SLA、RWC和WHC，是反映水分高效利用的叶片形态与水分生理指标，方差贡献率为9.127%。综合考虑各指标的测定难度、变异系数(表2)及其相关性(表6)，最终选择PH、Cchl和SLA作为评价不同核桃砧木幼苗WUE的核心指标。

表5 3个主成分的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率和原始变量间的相关性Table 5 Eigenvalues,proportion of total variability,as well as correlations between the original variables and the first 3 principal components

表6 干旱条件下7种核桃砧木实生幼苗各测定变量间的相关性Table 6 Bivariate correlations among the studied parameters of the seven walnut rootstock seedlings under drought condition

将高效水分利用主要性能指标原始数据标准化后，计算3个主成分的得分，以所选主成分对应的特征值占3个特征值总和的比例为权重，计算出不同核桃砧木的综合评价得分值(Y)，各得分值与相应特征值的方差贡献百分率的乘积累加得出不同核桃砧木的综合评价指数(S)，以此来评价不同核桃砧木的水分利用情况(表7)。由表7可知，7种核桃砧木幼苗水分高效利用综合排名由高到低依次为鸡爪绵、香玲、核桃楸、麻核桃、黑核桃、铁核桃和枫杨。

表7 干旱条件下7种核桃砧木实生幼苗的主成分值与综合评价指数值Table 7 Values of principal components and synthetic analysis indexes of the seven rootstock seedlings under drought condition

2.3.3 聚类分析法 基于干旱条件下14个水分利用相关功能性状，采用IBM.SPSS Statistics 20.0 Pearson相关性方法对7种核桃砧木进行聚类分析，得到聚类树状图(图2)，以此综合评价7种核桃砧木的水分高效利用能力。由图2可见，当距离为10时，将7种核桃砧木聚为3组，第1组为鸡爪绵和香玲，干旱条件下具有较好的生长表现，WUEL较大；第2组是核桃楸和麻核桃，干旱条件下生长表现中等，WUEL居中；第3组是铁核桃、黑核桃和枫杨，干旱条件下生长表现最差，WUEL较低。

图2 基于干旱条件下7个核桃砧木实生幼苗水分高效利用反映指标的聚类分析Fig.2 Cluster analysis for the seven walnut rootstock species based on the high water use efficiency characteristics under drought condition

3 讨 论

植物WUE是一个由多基因控制的可遗传的复合性状，反映植物在不同生境下的水分有效利用能力，是衡量植物生长和生境(尤其是水分亏缺)适应能力的重要指标；不同物种间及同一物种的不同品种间具有遗传特征决定的WUE差异，且对外界环境变化的响应敏感度存在差异[6-8]。本研究采用直接测定法对干旱条件下7种核桃砧木幼苗的WUEL进行了测定，结果表明：干旱条件下7种核桃砧木实生幼苗的WUEL存在显著的种间差异(P<0.001)，WUEL由高到低的顺序依次为鸡爪绵、香玲、核桃楸、麻核桃、黑核桃、铁核桃和枫杨。WUE是评价植物不同种质间抗旱性差异的重要指标，高WUE是植物具有较强抗旱能力的重要原理[1]，鸡爪绵和香玲的WUEL较高，表明两者具有较强的抗旱性，与前期研究结果一致[12-13]。

WUEL比叶片水平的瞬时水分利用效率(WUEI)更能准确地反映较长时间内的植物WUE，但用水量和生物产量的测定工作细致而繁琐，成本高且误差大；稳定碳同位素组成(δ13C)克服了WUEI和WUEL的缺点，测定方法快速、准确度高，是目前国际公认的评价植物WUE较为准确可靠的参数，但是δ13C的测定需要稳定同位素质谱仪，价格昂贵，测定费用较高[14]。近年来，越来越多的学者致力于研究作物生物学性状、农艺性状、产量性状等与水分利用相关的植物功能性状，了解这些性状与WUE的关系，以确定某一个或某几个简单易测的功能性状作为高效用水核心评价指标来评价作物WUE[8,15-17]。植物功能性状是植物与外界环境长期相互作用下形成的形态结构和生理生态等特征，是植物对生长环境响应和适应的表征，具有较强的可塑性，且简单易测，常用于反映植物生长和环境适应性[18-20]。资源竞争(如水分亏缺)是影响植物功能性状的重要因子，通过逆境条件下植物功能性状的改变可以揭示植物对逆境的适应机理，评估不同植物的逆境适应能力[21-23]。PH和TDB是反映植物生长状况的主要功能性状。合理分配生物量是逆境条件下植物获取资源、赢得竞争和成功繁殖的重要策略，RSR能反映植物对资源获取的竞争能力[22-23]。干旱条件下，植物通过调节RSR以响应资源竞争，保证有限水资源的最大化吸收，促进植株生长和生产，实现有限水资源的高效利用。叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，是连接植物与外界环境的重要桥梁，对外界环境变化十分敏感。与碳水通量相关的叶片功能性状主要包括TLA、LT、SLA、叶解剖结构、叶气孔密度、叶氮/磷含量、叶片光合色素含量、RWC、叶片光合和荧光参数等；水分亏缺条件下，植物会通过改变这些叶片功能性状来平衡碳的吸收和水分的损失，优化水分利用策略，提高WUE[18,20,24]。根是植物获取地下资源(土壤水分及溶解其中的无机盐)的主要植物器官，并具有支撑、繁殖、贮存和合成有机物质的作用。与碳水通量相关的根功能性状主要包括根长、根粗度、比根长、根解剖结构、根分级特征、根碳氮磷含量、菌根真菌特征等；干旱条件下，植物通过改变这些根功能性状来增加土壤的碳输入和固定，提高根系对土壤水分的有效吸收，以提高植物对土壤有限水资源的利用效率[18,20,23,25]。植物水分利用相关功能性状均能不同程度地反映植物对有限水资源的获取能力和对干旱生境的适应能力，其中叶片功能性状具有测量简单、可操作性强、能较好反映植物的生理功能以及环境适应能力。本研究测定了干旱条件下7种核桃砧木实生幼苗的14个水分利用相关功能性状指标，分析了它们与WUEL相关性。结果表明，WUEL与PH、BD、TDB、RSR、ARL、NLR、LT、WHC、Cchl、Pn和Fv/Fm均呈显著或极显著正相关性，与SLA呈显著负相关性。干旱条件下14个功能指标均存在不同程度的种间差异，其中PH、BD、TDB、RSR、ARL、NLR、TLA、SLA和Cchl变异系数>20.00%，存在较大的种间差异，表明这些功能性状的可塑性强，能较好地反映不同核桃砧木幼苗对有限水资源的获取和利用能力，反映不同核桃砧木幼苗对干旱的适应策略[20,23,26]，研究结果与其他物种的研究一致[27-29]。

基于多指标的模糊数学隶属函数评价法、主成分分析法和系统聚类分析法消除了种间或品种(系)间的固有差异，可较准确反映不同植物种间及种内不同品种(系)的差异，评价结果客观可靠，目前已成为作物种质资源及其抗逆性综合评价的主要方法[10,12,30]。本研究基于干旱条件下14个水分利用相关功能性状的综合分析，分别采用模糊数学隶属函数法、主成分分析法和聚类分析法对7种核桃砧木幼苗的高效用水性能进行了综合评价，消除了不同砧木品种间的固有差异，可真实反映不同砧木的WUE，使评价结果更加准确、可靠。根据各功能性状隶属函数平均值的大小对不同核桃砧木的水分利用能力进行排序，WUE由高到低的顺序为：鸡爪绵、香玲、核桃楸、麻核桃、铁核桃、黑核桃和枫杨。主成分分析法从14个水分利用相关功能性状中提取了3个主成分，反映所有高效用水功能性状指标的77.487%信息，综合考虑3个主成分的主要特征指标的测定难易程度、变异系数及其相关性，最终选择PH、Cchl和SLA作为评价不同核桃砧木幼苗WUE的核心指标。将高效用水主要性能指标原始数据标准化后，计算3个主成分的得分，以所选主成分对应的特征值占3个特征值总和的比例为权重，计算出不同核桃砧木的综合评价得分值，各得分值与相应特征值的方差贡献百分率的乘积累加得出不同核桃砧木的综合评价指数，以此来评价不同核桃砧木幼苗的WUE。依据综合评价指数明确了7种核桃砧木幼苗WUE由高到低依次为鸡爪绵、香玲、核桃楸、麻核桃、黑核桃、铁核桃和枫杨。在模糊数学隶属函数评价法和主成分分析评价法的基础上，根据核桃砧木的主要高效用水性能指标，对7种核桃砧木进行系统聚类分析，将其聚为3组。第1组为鸡爪绵和香玲，干旱条件下具有较好的生长表现，WUEL较大；第2组是核桃楸和麻核桃，干旱条件下生长表现中等，WUEL居中；第3组是黑核桃、铁核桃和枫杨，干旱条件下生长表现最差，WUEL较低。3种评价方法对7种核桃砧木幼苗WUE的评价结果基本一致，且评价结果与干旱结束时各砧木幼苗的生长状况和形态表现基本一致，说明这3种评价方法均可较准确地反映不同核桃砧木实生幼苗的水分利用特性，可为核桃高效用水砧木筛选提供参考。

4 结 论

干旱条件下，鸡爪绵和香玲核桃实生幼苗具有较好的生长表现，WUEL较大，且种子易获得，适合在干旱、半干旱核桃种植区广泛应用；铁核桃、黑核桃和枫杨实生幼苗生长表现差，WUEL较低，且种子不易获得，不适宜在干旱、半干旱核桃栽培区应用。本研究基于多个水分利用相关功能性状的模糊数学隶属函数法、主成分分析法和聚类分析法均能准确反映核桃砧木实生幼苗的WUE；PH、Cchl和SLA简单易测，可作为筛选核桃砧木实生幼苗的水分高效利用有效的形态和生理指标。研究结果可为核桃砧木高效用水综合评价提供了较为准确的评价方法，为植物水分高效利用育种提供简单有效的功能性状标记，也为进一步研究植物水分高效利用基因的QTL定位和克隆提供依据。