不同浓度稀土铽离子对枯草芽孢杆菌芽孢萌发的影响

尹京伟，宁周神，巢志英，金志兴，董伟

（江西理工大学 资源与环境工程学院，江西赣州 341000）

稀土素有“工业黄金”的美誉，被广泛应用于智能陶瓷、军事设备等领域[1]，可以提升金属材料的性能以及农作物的产量等。随着经济的快速发展及社会的不断进步，全球对稀土的需求量不断提升。我国作为稀土资源大国，对稀土的开采规模不断扩大，尽管随着经验的积累和科技的进步，采用的多种工艺流程和提取方法有了一定的提升，但依旧存在缺陷。而稀土的大量开采导致的土壤及地下水的污染[2-3]、山体滑坡、土壤酸化、植物破坏和生活环境的破坏[3]等问题也日益严峻。

前期研究表明，芽孢杆菌等菌株具有根际促生及稀土离子吸附等功能，在微生物修复污染矿山土壤中发挥重要作用[4-5]。本文对实验室保藏的枯草芽孢杆菌菌株进行稀土离子胁迫耐受性研究，以期搞清枯草芽孢杆菌的生物学特性，为其在离子型稀土矿山土壤修复的实践应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

枯草芽孢杆菌菌种由美国微生物科学院院士Peter Setlow（美国康涅狄格大学医学院，UConn Health）提供，在本实验室保藏。

1.2 试剂与仪器

氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酵母浸粉，生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨，生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；硝酸铽六水化合物，分析纯，上海化学试剂有限公司；2,6-吡啶二羧酸，分析纯，上海九鼎化学科技有限公司；HEPES，分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

YXQ-75SII型灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV755B型紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；SuPerMax300型多功能酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司；NCY-E200型相差显微镜，尼康仪器（上海）有限公司；JY92-IIN型超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；3H16RI型智能高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；HZQ-F400型立体式震荡培养箱，常州智博瑞仪器制造有限公司；TOMG-10C型微电脑生化培养箱，上海申安医疗器械厂。

1.3 培养基配方

LB液体培养基（1 L）：10 g氯化钠、10 g蛋白胨、5 g酵母浸粉，调pH至7.0左右。LB固体培养基额外添加18～20 g琼脂。

2×SG固体培养基配方：970 mL去离子水中加入营养肉汤16 g，1 mol/L MgSO4溶液2 mL，2 mol/L氯 化 钾 溶 液 13 mL，1 mol/L MnCl2溶 液 100 μL，0.036 mol/L FeSO4溶液 30 μL，琼脂粉 15 g，定容到1 L，高压灭菌，灭菌后加入单独灭菌的20 mL 50×硝酸钙·葡萄糖溶液。

1.4 芽孢的制备

1.4.1 菌种活化与培养

将枯草芽孢杆菌在LB固体培养基上划线，培养过夜后得到活化菌株。活化好的菌种接入LB液体培养基中，在37 ℃、250 r/min培养5 h得到菌液。取100 μL上述菌液于2×SG固体培养基中进行涂布，放入37 ℃培养箱中培养72 h。

1.4.2 芽孢制备

将培养基上的菌体收集至离心管，于4 ℃、8 000r/min离心10 min后除去杂质，用无菌水悬浮菌液，超声破碎6 min后离心除去细胞破碎物，反复多次，直至相差显微镜下观察到95%的菌体为明亮菌体，说明芽孢纯化完成。将制备好的芽孢放入4 ℃冰箱保存。

1.5 芽孢萌发测定

1.5.1 芽孢液体培养基萌发

取两EP管中的芽孢于15 mL离心管中，取一定量稀释一定倍数（设为X），测定溶液在600 nm处吸光度A（0.3～0.8），得到芽孢母液的OD浓度A0=A×X。

LB液体培养基中加入离心后的芽孢稀释液，于37 ℃、200 r/min下测定600 nm下未加芽孢和加芽孢后培养基吸光度，每5 min测量并记录1次数据。

以硝酸铽六水合物为原料制备10 mmol/L的Tb3+母液，配制不同浓度Tb3+（0 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L和1 000 μmol/L）的LB液体培养基的各50 mL，高压蒸汽灭菌后待用。

取OD值接近0.8的芽孢稀释液，离心后加入溶液中，每隔5 min测定并记录加入芽孢后培养基在600 nm下的吸光度。

1.5.2 芽孢萌发剂激活萌发

通过稀释一定倍数（X）后测得OD600A1为0.3～0.8，计算出芽孢母液的OD600A=X×A1，将芽孢母液稀释[(X×A1)/2]倍后得到OD600为2的芽孢母液。向酶标板孔中依次加入20 μL HEPES缓冲液和无菌水（作为补充），再各加100 μL OD600为2.0的芽孢母液，然后添加不同量的Tb3+母液（10 mmol/L），最后再各加入20 μL的缬氨酸（0.1 g/L）。在荧光激发波长为275 nm，发射波长为545 nm下每隔2 min测定酶标板内混合溶液的荧光强度[6]。

1.6 芽孢杆菌的耐胁迫实验

1.6.1 芽孢杆菌母液

对活化的菌种进行扩大培养：用LB液体培养基在37 ℃、180 r/min下培养12 h后获得枯草芽孢杆菌母液[8]。

1.6.2 加入菌后测定

制备含有不同浓度的Tb3（+0 μmol/L、600 μmol/L、1 200 μmol/L、1 800 μmol/L 和 2 400 μmol/L）的培养基各50 mL。在上述培养基中加1 mL芽孢杆菌母液，在37 ℃、200 r/min下培养。每隔1 h对加入菌液前后的培养基进行OD600连续测定。

2 结果与分析

2.1 铽离子对芽孢萌发及生长的影响

芽孢在含不同浓度铽离子的LB培养液中的萌发情况如图1、图2所示。结果表明，LB能够刺激芽孢萌发，当培养30～40 min后芽孢OD值降至原来的50%左右，此时芽孢全部萌发（相差显微镜下观察，芽孢已由明亮变为灰黑）。之后的时间OD值慢慢升高，芽孢经历长出过程，直至形成细胞，并进行繁殖。

图1 枯草芽孢杆菌芽孢在LB培养液中的萌发曲线

图2 不同浓度铽离子对枯草芽孢杆菌芽孢萌发影响

如图2所示，在低浓度的铽离子溶液中芽孢萌发基本相似，以0 μmol/L的Tb3+的实验为对照，可以看到1 000 μmol/L Tb3+会抑制芽孢杆菌芽孢的萌发，且抑制强度随着Tb3+浓度的升高而增强。上述结果表明，枯草芽孢杆菌芽孢的萌发受稀土离子的浓度影响较小，对稀土离子耐受性较强，离子型稀土矿山废水中的稀土离子浓度对于芽孢来说还在耐受范围之内。然而，浓度过高的Tb3+会抑制芽孢杆菌芽孢的萌发，抑制效果的强弱可以通过600 nm下达到最低吸光度的时间不同来表现（OD600的拐点表示芽孢全部萌发的时间点），时间越长则该浓度Tb3+的抑制效果越强，反之则抑制效果越弱。

2.2 芽孢萌发剂激活的萌发动力学

如图3所示，以缬氨酸为萌发剂，通过添加不同剂量的铽离子研究它对芽孢萌发的影响。结果表明，高浓度Tb3+抑制芽孢萌发，荧光强度的高低与结合物的量在一定范围内成正比。添加500 μmol/L铽离子测得的荧光强度比1 000 μmol/L的高，说明高于500 μmol/L的Tb3+会抑制芽孢的萌发。而比较500 μmol/L与200 μmol/L的Tb3+添加量发现，在200 μmol/L下Tb3+浓度未达到饱和，Tb3+饱和浓度应在200～1 000 μmol/L。

图3 铽离子对缬氨酸激活的芽孢萌发动力学影响

2.3 芽孢杆菌对铽离子的耐受性

不同铽离子浓度对枯草芽孢杆菌细胞生长的影响如图4所示。结果表明，在一定Tb3+浓度范围内，Tb3+的浓度越高对枯草芽孢杆菌的抑制作用越强。枯草芽孢杆菌的半致死Tb3+浓度大于2 400 μmol/L。

图4 铽离子对枯草芽孢杆菌细胞生长的影响

Tb3+浓度在500～1 000 μmol/L时，对枯草芽孢杆菌芽孢萌发及该菌的生长都有抑制作用，且浓度越高抑制作用越强。本研究结果与前期研究一致，即Tb3+浓度对芽孢杆菌芽孢萌发、细胞生长都有影响[9-11]。

3 结论

本文研究了稀土离子铽对枯草芽孢杆菌芽孢萌发、生长的影响，发现存在低浓度促进、高浓度抑制的现象。而对于离子型稀土矿山废水中的Tb3+来说，实际浓度远低于本实验用的抑制浓度，很可能对枯草芽孢杆菌的芽孢萌发以及生长有促进或者只有较弱的抑制效果。

因此，未来的研究方向主要为：（1）微生物与植物的联合修复研究，特别是根际促生菌的筛选利用以及利用转基因、基因编辑技术定向改造微生物以适用于治理离子型稀土矿山；（2）利用多种微生物联合吸附与回收稀土离子，从而减少稀土离子的流失和对矿山生态环境的破坏，实现离子型稀土资源绿色开发与应用。