重组海藻凝集素通过诱导细胞凋亡与自噬抑制宫颈癌细胞增殖

陈思琦，朱漪涵，义塘苇，曹国梅，代益，刘文权*

（1.江西医学高等专科学校 医学技术学院检验教研室，江西上饶 334000；2.温州医科大学 基础医学院人体寄生虫学教研室，浙江温州 325000）

近年来，随着我国政府大力推进宫颈癌的筛查工作，宫颈癌（HPV）疫苗的研发也取得了良好进展，对宫颈癌的防治起到了积极作用[1]。但由于需要疫苗接种的人群多、范围广，人们对接种疫苗的认知尚存在不足，加之进口疫苗价格高等因素，接种疫苗效果仍不甚理想。目前临床化疗药大部分为广谱杀伤性药物，多通过化学合成，缺乏对肿瘤治疗的靶向性和特异性，且存在不同程度的药物毒性[2]。因此，寻找一种更安全、高效且特异性靶向宫颈癌的药物是当前宫颈癌防治研究的重要目标之一。

凝集素（Lectin）属于碳水化合物结合蛋白家族，广泛存在于动植物和微生物中。凝集素对表面糖基化异常的多种肿瘤细胞均能产生细胞毒性或抑制生长，被认为是一种新的肿瘤治疗候选药物，现已证实一些植物凝集素主要通过诱导细胞凋亡和自噬途径在体内外表现出抗肿瘤活性[3]。

海藻凝集素（Griffithsin，GRFT）是从海洋红藻（Griffithsiasp.）中提取的一种含121个氨基酸、分子量为13 kDa的凝集素[4]。本研究采用MTT法检测重组海藻凝集素rGRFT对几种肿瘤细胞株的潜在抗增殖活性。在测试的几种癌细胞中，发现宫颈癌HeLa细胞对rGRFT的敏感性较高，并以此为模型进一步探讨了rGRFT抑制HeLa细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；Hoechst 33258染料，美国Sigma公司；RPMI-1640培养基、Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素，美国Gibco公司；Aelax-AnnexinV-PI试剂盒，美国invitrogen公司。

抗 caspase-3、caspase-8、bcl-2、bax、Bid 和β-actin的一抗，美国Cell Signaling公司；HRP标记的羊抗兔二抗，美国biosharp公司；纯化的葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖，美国Sigma-Aldrich公司。

人宫颈癌HeLa细胞、人包皮成纤维细胞（HFF）、人乳腺癌MCF-7细胞、人胰腺癌PANC-1细胞、人肝细胞癌细胞系HepG2，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

SmartSpec Plus型分光光度计，美国Biorad公司ChemiScope 6000增强型化学发光成像仪，上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 重组GRFT二聚体的表达和纯化

编码GRFT二聚体的基因GRFT-linker-GRFT交由TAKARA公司合成，并将其克隆至pUC载体。该基因由两个编码GRFT的基因通过柔性氨基酸链GS linker（GGSGGGSGGGSG）连接从而保证两个GRFT基因表达后可形成相互独立的单体结构。构建重组质粒pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT，转化至BL21感受态。经聚合酶链反应和测序鉴定后，将pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT/BL21在37 ℃下培养过夜，将菌液以1∶20的比例转入5 mL Amp+LB培养基中，继续培养至OD600=0.6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，15 ℃诱导表达22 h。收集细菌，用超声波粉碎离心后取上清的可溶性蛋白通过0.22 μm的细菌滤器，加入平衡好的镍NTA琼脂糖凝胶预装柱，用不同浓度的咪唑（10～500 mmol/L）洗脱液对重组GRFT蛋白进行纯化。最后采用透析法去除无机盐离子，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2 细胞培养

HFF、MCF-7和HepG2细胞使用DMEM培养基培养，HeLa和PANC-1细胞用RPMI-1640培养。所有细胞均在37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的条件下进行培养。收集指数生长期细胞进行增殖、凋亡、Western blot和PCR检测。

1.2.3 细胞增殖试验

采用MTT法检测 rGRFT对 HeLa、PANC-1、HepG2、MCF-7和HFF细胞的影响。将细胞置于96孔培养板（5×104个/孔）中过夜培养12 h，细胞分别与 0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L和100 mmol/L的rGRFT共同孵育48 h，每孔加入25 μL的MTT试验液（5 mg/mL），培养4 h后，取出培养液，每孔加入150 μL DMSO。涡旋混合后孵育10 min，用分光光度计测定590 nm处的吸光度。所有的实验都至少进行3次。

抑制率按照式（1）进行计算：

式（1）中：A0和A1分别为对照组和药物处理组在590 nm处的吸光值。

1.2.4 单糖抑制实验

将rGRFT与葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖三种单糖在37 ℃预孵育30 min，其他均与1.2.3方法相同。

1.2.5 Hoechst33258染色观察肿瘤细胞凋亡

将HeLa细胞（5×104个/L）接种至铺有盖玻片的六孔板中培养过夜，次日加入IC50剂量的rGRFT孵育24 h后，弃掉培养基，PBS洗涤3次，加入Hoechst33258染料避光孵育10 min，挑出盖玻片封片，在荧光显微镜下观察HeLa细胞核的形态变化。

1.2.6 Annexin-V/PI双染检测肿瘤细胞早期凋亡

将HeLa细胞（5×105个/L）接种于60 mm培养皿中，加入50 μg/mL rGRFT处理24 h、48 h。处理后，将细胞消化洗涤离心（1 000 r/min，10 min）重悬于100 μL 1×AnnexinV缓冲液中，加入5 μL AnnexinV-488Aelax和1 μL PI，室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测早期凋亡细胞的百分比。

1.2.7 Western blot

将HeLa细胞（1.0×106个/L）接种于10 cm3的培养皿中，待细胞生长至对数生长期后，给予rGRFT处理。处理后的细胞用冰冷的PBS洗涤，再悬浮在含有1%PMSF的RIPA缓冲液中，4 ℃作用30 min。裂解细胞在12 500×g，4 ℃下离心5 min，收集上清液蛋白，用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，15 V转膜25 min后，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗分别用 Caspase3（1∶ 1 000）、Caspase8（1∶ 1 000）、Bax（1∶ 1 000）、Bcl-2（1∶ 1 000）、Bid（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤3次后分别用HRP标记的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗（1∶5 000）稀释室温孵育1 h，使用增强型化学发光成像仪进行曝光显影。

1.2.8 统计学方法

实验数据为至少3次独立重复实验的数据，均用均值±标准差表示。用SPSS 19.0进行统计学分析，多组数据之间比较采用Dunnett检验，对两组数据之间比较采用ANOVA单因素方差分析，P＜0.05（*）和P＜0.01（**）分别表示数据具有统计学的显著差异和极显著差异。

2 结果与分析

2.1 GRFT重组二聚体构建及其对肿瘤细胞增殖的影响

重组质粒pColdⅢ-GRFT-linker-GRFT转化至BL21细菌，加入IPTG诱导在15 ℃表达22 h，收集细菌后超声裂解，将可溶性蛋白过Ni-NTA亲和柱，目的蛋白主要在咪唑浓度为40～80 mmol/L时洗脱下来，Western blot分析结果表明，29 kDa处的二聚体条带与14.5 kDa的两个单一GRFT单位的结合大小是一致的（图1a）。为了证实rGRFT二聚体与野生型蛋白具有相似的功能，用ELISA方法检测了GRFT二聚体与HIV gp160的结合活性。与BSA的阴性对照相比，rGRFT能与gp160显著结合（图1b），这表明重组蛋白确为GRFT二聚体，并且与野生型蛋白具有几乎相同的结构和功能。

采用MTT法检测GRFT对多种肿瘤细胞的生长抑制作用，并以原代HFF细胞作为正常对照。实验结果表明HeLa细胞对rGRFT更敏感，对MCF-7细胞和原代HFF细胞没有明显的细胞毒作用（图1c）。

图1 重组GRFT蛋白的表达及其对肿瘤细胞增殖的影响

因此，选择HeLa细胞进行下一步的研究，以剂量和时间依赖的方式用rGRFT处理HeLa细胞，MTT法检测rGRFT对HeLa细胞增殖的影响。结果显示，rGRFT能诱导HeLa细胞死亡，尤其是随着rGRFT浓度的升高（0～100 μg/mL），对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用（图1d），25 μg/mL GRFT作用24 h后，抑制率达50%以上。

通过单糖抑制实验确定rGRFT的糖结合活性与其抗增殖活性之间的关系。采用不同浓度的rGRFT分别与葡萄糖、甘露糖和N-乙酰氨基葡糖（NAG）预孵育30 min后再进行增殖活性检测。结果表明，单糖对rGRFT的抑癌作用没有明显的影响（图1e）。提示rGRFT的抗肿瘤细胞增殖作用与其糖结合活性之间没有联系。

2.2 rGRFT诱导HeLa细胞凋亡

诱导细胞凋亡是临床放射疗法和化学疗法抗肿瘤的一个重要靶点，凋亡过程可以消除过度产生、发育不正常或基因损伤的细胞[5]。为验证rGRFT诱导的自噬作用，通过Hoechst33258染色观察凋亡肿瘤细胞的细胞核形态变化。在荧光显微镜下观察到经50 μg/mL rGRFT处理后，HeLa细胞出现明显的凋亡形态学改变，如染色质聚集、核碎裂及出现凋亡小体。而未处理组（0 h）仍为正常圆形、均匀染色的细胞核。然而，50 μg/mL rGRFT在24 h或48 h处理后没有引起HFF细胞明显的凋亡形态。提示rGRFT可选择性地诱导HeLa细胞晚期凋亡，但不能诱导非癌性HFF细胞凋亡。

用Annexin-V/PI双染后，使用流式细胞仪检测rGRFT诱导的早期凋亡细胞百分比，以区分活细胞（Annexin V2/PI2）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI2）、晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）和坏死细胞（Annexin V2/PI+）。PBS处理的HeLa细胞存活率为95.1%，随着rGRFT加入浓度从25 μg/mL提高至50 μg/mL，细胞存活率从74.8%逐渐下降到43.5%，早期和晚期凋亡细胞比例从25%增加到53%。该结果MTT试验一致，证实rGRFT蛋白能诱导HeLa细胞早期凋亡。

2.3 rGRFT激活HeLa细胞凋亡信号通路

采用50 μg/mL rGRFT处理24 h和48 h HeLa细胞，Western blot检测凋亡相关蛋白Pro-caspase3、Caspase3、Pro-caspase8和Caspase8相对表达水平，探讨rGRFT诱导HeLa细胞凋亡的可能机制。结果表明，rGRFT激活HeLa细胞中的原天冬氨酸蛋白8（Pro-caspase8）和原半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Pro-caspase3），产生相应的43 kDa和17 kDa的切割片段，在48 h时效果最显著（图2a）。

图2 rGRFT激活HeLa细胞凋亡信号通路的检测

此外，还发现50 μg/mL rGRFT能激活线粒体膜上的Bcl-2家族。结果表明，rGRFT可显著提高HeLa细胞线粒体膜上促凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，Bax/Bcl-2比值与对照组（0 h）相比有显著性差异（P＜0.05），均为Caspase和线粒体依赖性凋亡的特征，提示rGRFT通过线粒体途径促进HeLa细胞凋亡（图2b）。

2.4 rGRFT诱导HeLa细胞自噬的检测

Western blot结果显示，经rGRFT处理后，HeLa细胞中LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，与未处理对照组相比，差异有统计学意义（图3a）。免疫荧光分析显示，rGRFT处理的HeLa细胞LC3呈聚集分布，而对照组呈弥漫分布，处理后24 h组荧光强度与对照组比较差异有统计学意义（图3b）。

图3 rGRFT诱导HeLa细胞自噬的检测

3 结论

许多报道表明，凝集素通过其碳水化合物结合能力诱导肿瘤细胞凋亡。玉竹凝集素是从中草药玉竹（Polygonatum odoratum）中提取的甘露糖结合凝集素（GNA）相关的凝集素家族。甘露糖α（1,3和1,6）可抑制甘露糖对人非小细胞肺癌A549细胞的诱导凋亡作用[6]。相反，本研究表明，应用半乳糖不能抑制rGRFT对肿瘤细胞的抗增殖作用，rGRFT通过其他结构域而不是其半乳糖结合域与肿瘤细胞相互作用。

本研究结果证实，与其他凝集素类似，GRFT通过诱导细胞凋亡和激活自噬信号通路在HeLa细胞中发挥其死亡诱导作用。随着培养时间的延长，rGRFT处理的HeLa细胞早期和晚期凋亡细胞增加，而存活细胞下降。rGRFT处理导致Caspase3/9激活，细胞色素C释放，线粒体膜电位降低，促凋亡的Bax和Bid上调，抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xl下调，PARP断裂，这些都是Caspase和线粒体依赖性凋亡的特征。除凋亡外，rGRFT还诱导HeLa细胞发生自噬，表现为经rGRFT作用后HeLa细胞LC3呈聚集分布，而对照组LC3呈弥散状态，表明促进LC3-I的表达和向LC3-II的转化。

现今发现的许多植物凝集素虽然对癌症细胞有一定的抑制效应，但对正常细胞总是表现出不良的副作用。本研究发现rGRFT对HeLa细胞有较强的毒性作用，同时不表现出人类T细胞有丝分裂活性，也不会诱导经过处理的人类细胞系（如外周血单个核细胞（PBMC）和宫颈阴道细胞）产生促炎细胞因子[7]，安全性较高。因此，GRFT在安全性方面比其他植物凝集素更具吸引力，本研究结果将为开发GRFT类抗宫颈癌药物以及预防HIV感染提供新的方向。