载脂蛋白E基因多态性与河北地区汉族人群缺血性脑卒中发病的关系

苟东芸，苑梦伟，何莎，吕秀娟，王云鹏，王梦娇，李姝颖，马晓伟，3

1河北医科大学第一医院神经内科，石家庄050031；2河北医科大学基础医学院；3河北省神经退行性疾病机制研究重点实验室

缺血性脑卒中是一种复杂的、受遗传等多因素影响的疾病，其发病率、病死率和致残率均较高。在过去的30年里，我国脑卒中发病率显著增加，全国每年新发脑卒中患者约240万人。荟萃分析表明，缺血性脑卒中的发生与载脂蛋白E(ApoE)基因多态性相关[1]，高血压、糖尿病、高脂血症、冠状动脉粥样硬化作为缺血性脑卒中的危险因素，与ApoE基因多态性也存在一定的相关性[2-4]。ApoE基因编码的ApoE蛋白是一种富含精氨酸的碱性蛋白，在外周组织中，ApoE主要在肝脏中合成、分泌，参与外周循环中胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)等脂质的运输和代谢；在中枢神经系统中，ApoE主要在星型胶质细胞中合成和分泌，通过与细胞表面ApoE受体结合，参与脑内胆固醇的运输及神经元和胶质细胞之间代谢物的细胞间交换[5]。ApoE基因主要有526C>T和388T>C两个多态性位点，二者形成3种等位基因ε2(388T-526T)、ε3(388T-526C)、ε4(388C-526C)和6种基因表型ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε4/ε4、ε2/ε2[6]。在中国人群中，ApoE ε4等位基因携带者罹患缺血性脑卒中的风险较ε2和ε3等位基因携带者明显升高[7-8]。脑卒中的发病率和病死率在我国的空间分布上存在由北向南的梯度，呈现北方高、南方低的趋势，脑卒中负担最重的是北部和中部地区[9]。然而目前对于河北地区汉族人群ApoE基因多态性与缺血性脑卒中发病的关系尚不明确。本研究对河北地区汉族缺血性脑卒中患者进行ApoE基因多态性位点分析，分析ApoE基因多态性与河北地区汉族人群缺血性脑卒中发病的关系，旨在为缺血性脑卒中的预防提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2019年9月—10月于河北医科大学第一医院就诊的128例缺血性脑卒中患者(观察组)。纳入标准：年龄≥40岁；籍贯为河北地区，民族为汉族，无血缘关系和异族通婚史；经脑CT或MRI检查证实颅内有缺血性病灶；3个月内未服用过降脂药物。排除心源性栓塞、冠心病、痴呆、严重感染、肝肾功能异常、恶性肿瘤、甲状腺和血液系统疾病。另选择性别、年龄匹配的来自体检中心的健康查体者125例作为对照组。观察组男51例，女77例，年龄(59.70±9.74)岁，BMI(25.73±4.31)kg/m2，合并高血压83例、糖尿病26例、高脂血症85例，有吸烟史36例、饮酒史38例、卒中家族史12例，颈部血管锁骨下动脉超声显示存在颈动脉斑块101例；对照组男65例、女60例，年龄(58.24±10.18)岁，BMI(25.05±3.17)kg/m2，合并高血压51例、糖尿病19例、高脂血症58例，有吸烟史22例、饮酒史25例、卒中家族史18例，存在颈动脉斑块56例。两组性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史及糖尿病较差异均无统计学意义(P均>0.05)，观察组高血压、高脂血症及颈动脉斑块发生率均高于对照组(P均<0.01)。本研究经河北医科大学第一医院伦理委员会审批，患者及家属对研究项目知情并签署知情同意书。

1.2 血液ApoE基因多态性检测 采用聚合酶链反应(PCR)—荧光探针技术。采集受试者空腹静脉血2 mL，EDTA抗凝，使用人全血核酸提取试剂盒提取血液中的基因组DNA。在2 L待测样本的基因组DNA(推荐浓度为5～15 ng/μL)、弱阳性对照和空白对照中分别加入装有23 L SLCO1B1*lb、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4反应液的反应管中，再进行PCR扩增。PCR反应条件：37 ℃ 10 min；95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，40个循环(设置在此阶段结束时采集荧光信号)。荧光信号的收集定为FAM(ApoE ε2 526C、ApoE ε4 388T)、VIC(ApoE ε2 526T、ApoE ε4 388C)和ROX(内标)。反应结束后，根据扩增曲线，划定合适基线(一般起始设定为3，终设定为15)和荧光阀值(一般将阈值划定在扩增曲对数形式下指数增长期的中间)，得到不同通道Ct值并按照表1进行结果判定。ApoE基因包括3种等位基因ε2、ε3、ε4和6种基因表型ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε4/ε4、ε2/ε2。

表1 ApoE基因多态性判定标准

2 结果

2.1 两组ApoE基因多态性分布情况比较 观察组ε2等位基因携带者(ε2/ε2+ε2/ε3)17例(13.3%)，ε3等位基因携带者(ε3/ε3+ε2/ε4)87例(68.0%)，ε4等位基因携带者(ε3/ε4+ε4/ε4)24例(18.8%)；对照组分别为21例(16.8%)、92例(73.6%)、12例(9.6%)。观察组ε4等位基因携带者所占比例高于对照组(P均<0.05)。

2.2 ApoE ε4等位基因对缺血性脑卒中发病的影响 单因素Logistic回归分析显示，ApoE ε4等位基因(OR=2.542，95%CI为1.041～6.209，P=0.041)、高血压(OR=2.851，95%CI为1.498～5.424，P=0.001)、颈动脉斑块(OR=4.514，95%CI为2.366～8.611，P<0.000)是缺血性脑卒中的危险因素，见表2。校正单因素回归分析中P<0.15的因素后，将TG、ε4等位基因、高血压、颈动脉斑块、BMI纳入多因素回归方程中，使用前进法分析，结果未显示ε4等位基因是缺血性脑卒中发生的危险因素。见表3。

3 讨论

ApoE是一种富含精氨酸的碱性蛋白，由人类19号染色体上的ApoE基因编码，其分子量为34 kDa，由299个氨基酸组成。526C>T和388T>C是ApoE基因最常见、最主要的两个多态性位点，ApoE 526C>T多态性促进ApoE第112位的半胱氨酸转变为精氨酸，而388T>C促进蛋白质第158位的精氨酸转变为半胱氨酸，这些氨基酸替换导致蛋白质结构和功能上的差异，使其具有不同的亲和力。在ε2、ε3、ε4这3种等位基因中，ε4亲和力最高，ε2亲和力最低，因此对血脂代谢产生相反的影响[10]。研究显示，ε2等位基因携带者血浆ApoE含量最高，LDL、TC含量较低，而ε4等位基因携带者则相反[11]。这提示ApoE基因多态性与血脂有关，ApoE基因可能通过调控血脂参与缺血性脑卒中的发生发展。

表2 缺血性脑卒中发病影响因素的单因素Logistic回归分析结果

表3 缺血性脑卒中发病影响因素的多因素前进法Logistic回归分析结果

近年来，诸多荟萃分析报告了缺血性脑卒中和ε4等位基因之间的显著关联。ApoE基因多态性一方面可能通过调控缺血性脑卒中的危险因素进而间接影响其发生和进展，另一方面也可能通过介导神经元突触的完整性和可塑性及血脑屏障的完整性直接影响缺血性脑卒中的发生发展[5-6]。研究发现，亚洲缺血性脑卒中患者的ε4等位基因频率高于高加索人群，ε4等位基因携带者在亚洲人群中更容易发生缺血性脑卒中[12-13]；在中国人群中，携带ε4等位基因增加了罹患缺血性脑卒中的风险[7-8]。本研究对河北地区汉族人群的ApoE基因多态性进行检测，结果显示，观察组ApoE ε4等位基因频率高于正常对照组，这与以往针对中国人群的研究[1,7,14]结果相似，提示ApoE ε4等位基因可能提高了缺血性脑卒中的发生率。但后续的Logistic回归在调整TG、高血压、颈动脉斑块、BMI等危险因素后，发现ApoE基因多态性并非河北地区汉族人群缺血性脑卒中的独立危险因素，这与韩国人群[15]、桂西壮族人群[16]的研究结果一致，但不同于广州地区人群[17]、中国西北地区汉族人群[18]的研究。其原因可能与以下两种因素有关：一是ApoE基因多态性的分布存在地区和种族差异，因此出现地区和民族的差异；二是本研究样本量较少，且排除了冠心病、痴呆等与ApoE基因多态性关联性很强的疾病，减少了该类疾病对ApoE基因多态性分布的影响，因此出现与以上地区研究结果的差异。

综上所述，在河北地区汉族人群中，缺血性脑卒中患者ApoE ε4等位基因频率较健康人群增高，ε4等位基因携带者高脂血症的发病率高于ε2、ε3等位基因携带，但ε4等位基因并非缺血性脑卒中的独立危险因素。尽管ε4等位基因非缺血性脑卒中的独立危险因素，但它可能通过调控血脂间接影响缺血性脑卒中的发生。提示我们对于携带ApoE风险类基因型的缺血性脑卒中人群，有必要密切关注其血脂水平；对不同地区的人群进行ApoE基因多态性监测，能够为该地区预防缺血性脑卒中提供进一步保障。